膜联蛋白A2和高半胱氨酸对视网膜新生血管形成调节机制研究

Retinal neovascularization (RNV) induced by diabetes and premature children is a kind of severe lesions blinding disease, whose pathogenic mechanism is not clear currently. There are studies confirming that annexin A2 (ANXA2) plays an important role in RNV formation and maintaining the balance of vascular fibrin, but the specific mechanism is unclear yet. Recently studies reveal that outside the vascular endothelial cells (EC) membrane there exists Homocysteine (HC) which competes with tPA for the combination with ANXA2, leading to fibrin concentration and fibrin system imbalance, which will cause two different pathological processes as vascular injury and neovascularization. Our previous study showed that the HC can combine with plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), and then inhibit the fibrin degradation process mediated by ANXA2. In order to study the relationship and the mechanism of neovascularization induced by the fibrin imbalance of ANXA2, HC , tPA and PAI-1. This project will study the role of ANXA2, HC , tPA and PAI-1 in the fibrin degradation balance using multiple experiments methods as vitro interference with the relevant factor, quantitative PCR, dual luciferase reporter gene, immunohistochemistry and fluorescent perfusion in the process of RNV formation induced by ANXA2 and PAI-1 gene knockout mice under hypoxic condition, to find new drug targets for the treatment of RNV.

糖尿病和早产儿等引起的视网膜新生血管（RNV）病变是严重的致盲眼病，目前发病机制尚不十分明确。研究证实膜联蛋白A2(ANXA2)在维持血管纤维蛋白系统平衡和RNV形成中具有重要作用，但其具体机制还不清楚。近年来发现血管内皮细胞（EC）膜外高半光氨酸（HC）能与tPA竞争结合ANXA2，导致纤维蛋白集聚和纤维蛋白溶解系统平衡失调，引起血管损伤和新生血管形成。我们研究发现HC能与纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）结合，抑制ANXA2介导的纤维蛋白降解过程。本课题拟应用缺氧诱导ANXA2和PAI-1基因敲除小鼠，采用基因和蛋白干扰、定量PCR、免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因、免疫组织化学和荧光灌注造影等实验手段研究ANXA2、HC、tPA和PAI-1在纤维蛋白溶解平衡中的相互作用机制，为探索防治RNV新的药物靶点奠定理论基础。

糖尿病和早产儿等引起的视网膜新生血管(RNV)病变是严重的致盲性眼病,发病机制尚不十分明确。目前认为纤维蛋白溶解系统平衡失调是导致血管损伤和新生血管形成的重要因素。研究表明糖尿病和早产儿患者常伴有高半胱氨酸(Homocysteine,HC)血症，HC可以与膜联蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)相互作用，导致纤维蛋白集聚和纤维蛋白溶解系统平衡失调，引起内皮细胞和血管损伤。而我们研究发现，在纤维蛋白溶解系统平衡失调、内皮细胞损伤和新生血管形成过程中，膜联蛋白A2受体（Annexin A2 receptor, AXⅡR）起着非常重要的调节作用。我们用重组AXⅡR（rAXⅡR）、小RNA干扰AXⅡR（siAXⅡR）表达，通过细胞增殖和迁移实验、细胞周期和凋亡实验、细胞血管形成实验、实时定量PCR、Western-Blot和免疫组织化学等方法检测了HC、AXⅡR、纤溶酶原激活物抑制物 1（PAI-1）、ANXA2和MMP的之间相互作用。 研究结果表明：HC可以明显抑制AXⅡR的表达, 而并不影响ANXA2的表达水平变化。用rAXⅡR可以明显抑制HC促进PAI-1的表达作用，并促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成。用siAXⅡR处理后的内皮细胞，其增殖、迁移和体内外血管生成能力均明显下降。用流式细胞仪技术检测siAXⅡR对细胞凋亡及周期的影响，以及基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9）表达的影响。发现siAXⅡR可以在mRNA水平及蛋白水平明显降低MMP2、MMP9的表达。发现siAXⅡR可以抑制细胞周期于S期，而对细胞凋亡无影响。.综上所述AXⅡR在HC介导的内皮细胞损伤、增殖和血管生成中起重要作用。AXⅡR可与HC特异性结合抑制HC的生物活性，维护血管的稳定性；AXⅡR可以直接抑制PAI-1的表达，促进内皮细胞增殖、迁移和血管形成作用；HC抑制新生血管形成的途径可能通过两条途径：一个是HC通过抑制AXⅡR的表达, 阻止ANXA2与AXⅡR的结合，导致MMP2和MMP9活性降低，内皮细胞增殖和新生血管形成作用下降。另一个是 HC通过促进PAI-1的表达，抑制PLG转化成PL，从而抑制内皮细胞迁移及血管生成作用。AXⅡR可能是维持血管纤维蛋白溶解系统平衡和内皮细胞稳定的的关键分子之一。