基于Nrf2/ARE信号通路的薏米香豆酸糖苷抗氧化分子机制及构效关系研究

Adlay, as a kind of high nutritional value of healthy food, has powerful antioxidant ability.The traditional evaluation methods of antioxidant, cannot fully explain the composition with antioxidation and antioxidant mechanisms. The Nrf2/ARE signal pathway has become a research hotspot in the field of antioxidant in recent years,but there are still many problems can not be explained in antioxidant mechanism of adlay polyphenols mediated by the Nrf2/ARE signaling pathway.Through the preliminary study,this project will take the coumaric acid glycoside as research target,which isolated from adlay polyphenols extract.We first investigate the antioxidant activity of coumaric acid glycoside and its effects on activity of various antioxidase in HepG2 cell. Furthermore,we research the influence of adlay coumaric acid glycoside on antioxidant enzyme gene and proteins expression by the methods of fluorescence quantitative PCR and Western-Blot blotting.Then we study the molecular mechanism of activating Nrf2/ARE pathway by adlay coumaric acid glycoside, by the means of gene mutation,RNA interference experiments and so on.To ascertain the structure-function relationship between the structural changes in the coumarin glycoside and the antioxidant activity, molecular mechanism in HepG2 cell through using the quantitative structure-activity relationship (QSAR) model. The deliverables will obtain the molecular mechanism and structure-function relationship of the antineoplastic activity of this coumaric acid glucoside, not only to provide a new choice for the development of natural health food of adlay, but also to provide a scientific basis for the further explicit function mechanism of adlay coumaric acid glycoside.

薏米作为一种营养价值很高的健康食品，具有良好的抗氧化能力，传统的抗氧化评价方式，不能完全解释其抗氧化功能成分及抗氧化作用机制。Nrf2/ARE信号通路是学术界近几年抗氧化研究领域的热点，但由该信号通路介导的薏米多酚抗氧化机制还存在许多无法解释说明的问题。因此，本项目在前期研究基础上，以从薏米多酚提取物中分离纯化得到的薏米香豆酸糖苷为研究对象，首先考察其抗氧化活性以及对HepG2细胞内多种抗氧化酶活力的影响；进一步采用荧光定量PCR、免疫印迹技术研究其对抗氧化酶相关基因蛋白表达的影响；再次通过基因突变、RNA片段干扰实验等方法探索其作用于Nrf2/ARE信号通路的分子机制；最后运用定量结构-活性关系（QSAR）模型，探明薏米香豆酸糖苷的结构变化与抗氧化活性及细胞内抗氧化分子机制之间的构效关系。本项目不仅为开发天然薏米健康食品提供新选择，也为深入明确薏米香豆酸糖苷抗氧化作用机理提供科学依据。

薏米是我国最古老的作物之一，作为一种传统的全谷物食品，薏米营养价值很高，被誉为“世界禾本科植物之王”，其活性成分的研究一直是相关领域的研究热点。在薏米多酚类物质抗氧化作用机理研究方面，目前已有的研究多是对薏米香豆酸及其衍生物的生物活性作用研究，并通过多种细胞模型逐步深入到分子机制上，但未见有研究其对Nrf2/ARE信号通路抗氧化机制的影响。因此本项目分别对薏米游离多酚和结合多酚进行分离纯化及结构鉴定，并以得到薏米香豆酸糖苷为研究对象，考察其抗氧化活性、抗肿瘤活性以及对对HepG-2细胞凋亡的影响；同时对HepG2细胞内多种抗氧化酶活力的影响进行研究，进一步采用免疫印迹技术、荧光定量PCR研究其对抗氧化酶相关基因蛋白表达的影响，探索其作用于Nrf2/ARE信号通路的分子机制。结果表明：从薏米游离多酚中主要分离纯化得到N1,N5-双(对香豆酰)亚精胺、对香豆酸、阿魏酸、芦丁，且都具有良好的抗氧化性，可以提高细胞中总抗氧化能力，提高细胞中抗氧化酶SOD，CAT和GPx的酶活性，降低脂质氧化水平，其中在薏米中首次分离并鉴定的N1，N5-双(对香豆酰)亚精胺（106.41 ± 3.43mg/g）的作用最为显著，能够刺激Nrf2细胞进行核转移，激活Nrf2/ARE信号通路，进而影响了由Nrf2/ARE信号控制的抗氧化酶的表达。同时，通过实时荧光定量 PCR发现N1，N5-双(对香豆酰)亚精胺处理后能够提高HepG2细胞中的几种抗氧化酶——γ-GCS、GSH-Px、SOD以及HO-1的基因表达量，有促进Nrf2核转移进而诱导调其下游抗氧化酶基因的表达的作用。此外，阿魏酸(1.65±0.09mg/g)是薏米结合型多酚的主要物质，在0.2mg/mL-0.5mg/mL范围内对氧化损伤HepG2细胞具有保护作用；经0.5mg/mL阿魏酸处理的HepG2细胞中，HO-1与GCLC的蛋白表达量是对照组蛋白表达量的3及4倍，表明阿魏酸能够极大地促进HO-1与GCLC蛋白的表达。综上，本项目系统分析和表征了薏米中典型生物活性多酚，并对其活性机制进行了全面的解析和揭示，阐明了薏米活性物质的种类和结构特征，为薏米深加工和附加值的提升提供了新的依据与理论。