基于ASK1结合位点的HSP27模拟肽对蛛网膜下腔出血后脑损伤的保护作用及机制研究

Neuroinflammation and neuronal apoptosis induced by overactivation of microglia occur after subarachnoid hemorrhage (SAH). Our previous studies showed that A. Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) activity increased, and heat shock protein 27 (HSP27) expression and activity increased following SAH; B. The N-terminal of HSP27 directly bounds ASK1 kinase domain, and HSP27-mimicking peptide based on this key region(TAT-ASK1-HSP27 mimicking peptide) targets ASK1 and inhibit its activity. It suggests that HSP27-ASK1 interaction after SAH may be the key mechanism of neuroinflammatory response and neuronal apoptosis. HSP27-mimicking peptide based on ASK1 binding site may alleviate neuroinflammation and neuronal apoptosis after SAH through inhibiting ASK1 activity. This project will use HSP27 transgenic and ASK1 knockout mice, primary cultured microglia and cortical neurons to establish in vivo and in vitro SAH models, to investigate: A. The effects of HSP27-ASK1 interaction on microglial polarization and neuronal apoptosis after SAH; B. TAT-ASK1-HSP27 mimicking peptide may play a neuroprotective role and improve neurological outcome of SAH by inhibiting the overactivation of microglia and reducing neuronal apoptosis.This project will provide new ideas and new targets for the treatment of SAH, and will be of great value for clinical translation.

蛛网膜下腔出血(SAH)后发生小胶质细胞过度激活介导的神经炎症及神经元凋亡。我们前期研究发现：SAH后凋亡信号调节激酶1(ASK1)活性升高，热休克蛋白27(HSP27)的表达及活性亦升高；HSP27 N端直接结合ASK1激酶的关键区域模拟肽靶向ASK1且抑制其活性。提示HSP27-ASK1相互作用可能是SAH后炎症和神经元凋亡的关键机制，基于ASK1结合位点的HSP27模拟肽可能通过抑制ASK1活性而减轻SAH后神经炎症和神经元凋亡。本项目将利用HSP27转基因及ASK1基因敲除小鼠、培养小胶质细胞和神经元建立SAH在体及离体模型，探讨a:HSP27-ASK1相互作用对SAH后小胶质细胞极化和神经元凋亡的影响;b.TAT-ASK1-HSP27模拟肽通过抑制SAH后小胶质细胞过度活化，减少神经元凋亡，发挥神经保护作用。本项目将为SAH后治疗提供新思路和新标靶，且具有重大临床转化价值。

本项目按照研究计划进行，进展顺利，达到了预期效果。蛛网膜下腔出血（SAH）后发生小胶质细胞过度激活等所介导的神经炎症及神经元凋亡是继发性脑损伤发生的关键。SAH后凋亡信号调节激酶1(ASK1)活性升高，热休克蛋白27(HSP27)的表达及活性亦发生明显变化；HSP27 N端直接结合ASK1激酶的关键区域而抑制其活性。本项目利用SAH患者资料、离体细胞，及大鼠SAH模型，研究了HSP27在SAH继发性脑损伤中的作用及基于抑制ASK1的有关机制，设计了基于ASK1结合位点的HSP27模拟短肽，并探讨了其对SAH继发性脑损伤的保护作用及基于ASK1、炎症反应、细胞凋亡等有关机制。研究了SAH患者脑脊液HSP27水平变化，发现HSP27水平在SAH后第一天出现明显增高，而后下降，但高于对照组，HSP27水平变化可在一定程度上预测SAH患者的总体预后，以及迟发性脑缺血等并发症的发生。利用大鼠模型，研究发现了SAH后HSP27表达水平的变化规律，无论在神经元以及小胶质细胞，HSP27的表达量均出现下降，表明HSP27表达下调或耗竭可能与SAH后继发性脑损伤有关。使用腺病毒携带或干扰HSP27基因的转染方法构建了转基因大鼠，建立SAH大鼠模型，发现过表达HSP27抑制SAH后神经炎症反应，促进小胶质细胞极化状态由M1型向M2型转化，同时明显减轻由SAH所致的皮层等神经元凋亡。而低表达HSP27则加重SAH后神经炎症反应，小胶质细胞1型标记物表达增加；低表达HSP27促进SAH后皮层等神经细胞凋亡。通过分子生物学检测，证实HSP27在SAH中的神经保护作用与其与ASK1相互作用、抑制ASK1活性有关。构建了基于与ASK1相互作用的模拟短肽TAT-HSP27。利用原代培养的神经元细胞，在细胞水平上对模拟肽TAT-HSP27有效肽段进行检测和验证，表明TAT-HSP27的有效肽段为aa65-90。在大鼠SAH模型，发现外周应用TAT-HSP27可有效通过血脑屏障进入脑内，模拟肽TAT-HSP27可有效减少SAH后多种凋亡相关蛋白的表达，减轻神经元凋亡，能够显著改善SAH的长时程神经功能预后。本项目为SAH防治提供了新的靶点和潜在治疗策略。已取得了一批有特色、有影响的成果。已发表多篇有影响力的学术论文，获得了发明专利及山东省自然科学二等奖，并在学术交流、人才培养等方面发挥了重要作用。