枯草溶菌素转化酶9对动脉粥样硬化巨噬细胞炎症反应的调控及作用机制研究

It is well known that proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a key regulator of serum cholesterol. In addition to the regulation of lipid metabolism, recent studies have suggested novel biological activities of PCSK9 which may function in atherogenesis. We previously showed PCSK9 promoted oxLDL-induced macrophage inflammatory response and the potential mechanism may be related to the interaction between PCSK9 and TLR4. Therefore, we hypothesize that PCSK9 regulates the macrophage inflammatory responses through TLR4/NF-κB signaling pathway. In this study, we will use gene transfection and RNA interference to overexpress and silence PCSK9 and observe the effect of PCSK9 on macrophage inflammatory responses. Secondly, the interaction between PCSK9 and TLR4 will be further explored using co-immunoprecipitation and immunofluorescence technique. Finally, the molecular mechanism of PCSK9-regulated macrophage inflammatory responses will be investigated by blocking TLR4/NF-κB signaling pathways. This project is expected to show novel functions of PCSK9 on As, which may provide new strategies for As prevention and treatment.

枯草溶菌素转化酶9（PCSK9）是一个脂质代谢调节基因，研究表明，PCSK9除调节脂质代谢之外，在As发病中还存在其他作用机制。课题组前期发现oxLDL可上调巨噬细胞PCSK9表达，PCSK9参与了oxLDL诱导的巨噬细胞炎症反应，预实验初步证实PCSK9可与TLR4相互作用。从而提出科研假说"PCSK9通过TLR4/NF-κB信号通路调控巨噬细胞炎症反应"。本项目将首先在整体动物模型和细胞模型上，采用基因转染和RNA干扰技术，以明确PCSK9表达改变对巨噬细胞炎症反应的影响。其次，运用免疫共沉淀及免疫荧光技术，进一步确定PCSK9与TLR4相互作用结合。最后，采用信号通路分级干扰策略，以阐明PCSK9对巨噬细胞炎症反应的调控作用是通过激活TLR4/NF-κB信号通路所介导。本研究可为揭示PCSK9在As发病中的作用机制提供新观点，并为As治疗提供新思路。

枯草溶菌素转化酶9（PCSK9）已经成为降脂药物研发及动脉粥样硬化(As)干预的热门靶点。目前研究主要是阐明了PCSK9通过调节肝脏脂质代谢从而影响血脂，间接参与As发生。但是，有研究认为除了影响血液LDL-C水平之外，在As发病中还存在其他作用机制。本研究提出了“PCSK9通过TLR4/NF-κB信号通路调控巨噬细胞炎症反应”的科学假设。为回答这一科学问题，我们首先检测了PCSK9在As斑块中的表达情况以及是否与巨噬细胞共定位，并观察了氧化低密度脂蛋白（oxLDL）对巨噬细胞PCSK9表达的影响；其次，采用ApoE-/-小鼠，通过尾静脉注射PCSK9-shRNA慢病毒载体，并高脂喂养复制As动物模型，在此基础上观察了PCSK9-shRNA对ApoE-/-小鼠As病变及其斑块局部炎症的影响，并探讨了TLR4/NF-κB信号通路在此过程中的作用。然后，通过构建PCSK9过表达慢病毒载体和PCSK9-shRNA慢病毒载体，上调或抑制巨噬细胞PCSK9表达，观察PCSK9表达改变对巨噬细胞炎症因子分泌以及TLR4/NF-κB信号通路的影响。最后，采用NF-κB抑制剂PDTC干扰，以阐明PCSK9对巨噬细胞炎症反应的调控作用是通过激活TLR4/NF-κB信号通路所介导。结果表明，① PCSK9在As斑块中存在表达且与巨噬细胞共定位，oxLDL呈浓度和时间依赖性上调巨噬细胞中PCSK9表达。② 抑制PCSK9表达能够减少ApoE-/-小鼠As斑块局部炎症反应，抑制小鼠As病变形成，其机制可能与下调小鼠主动脉TLR4的表达以及降低NF-κB的活性有关。③ PCSK9过表达能促进oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1分泌，并能加剧oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞TLR4蛋白质表达的上调以及NF-κB活性增强（p-IkBα表达上调、IkBα的降解以及NF-κB核转位），PCSK9低表达的作用则与其相反；加入PDTC阻断TLR4/NF-κB信号通路后，PCSK9过表达对巨噬细胞炎症反应的促进作用则被逆转。上述结果可为揭示PCSK9在As发病中的作用及机制提供新观点，并为确立PCSK9作为As治疗新靶点提供更充分的科学依据。