二至丸保肝的体内效应成分及其协同作用机制研究

The drug-induced liver injury (DILI) is a serious public health problem to be solved. Our previous studies have shown that Er Zhi Pill (EZP) can effectively control the occurrence and development of DILI, but its Effects of multi-component and their synergistic mechanism on protecting liver is not clear. We are proposed that a new idea is study on Multi-target integration synergies mechanism of prescriptions based on its multi- component synergies relationship in vivo. Establish HPLC-MS/MS method to study EZP multi-component synergistic relationship and its pharmacokinetic characteristics, Exploration and research its compatibility material foundation connotation. Establish DILI animal models, observed EZP and its multi-component synergistic effects on protecting liver, Establish Time - dose - effect relationship model and composition - distribution - effect relationship model, exploration and research its compatibility connotation of Synergistic effects on Protecting Liver. On Overall, organs, cells, molecular level, to study the mechanism of EZP on suppress or impedance of DILI the inflammatory response and modulation of immune system disorders, Explore its the multi-target integration synergies mechanism on protecting liver. The results of this study have important practical value for to clarify EZP prevention DILI material foundation and mechanism and Provide a scientific basis for the clinical application; For exploring the content of prescription compatibility has important theoretical significance and scientific value.

药物性肝损伤（DILI）是亟待解决的严重公共卫生问题，我们前期研究表明：二至丸能够有效地防治DILI的发生与发展，但其保肝的多靶点协同作用及其机制尚不清楚。我们提出基于方剂体内效应成分协同关系的多靶点整合协同作用机制研究新思路。拟采用HPLC-MS/MS法，研究二至丸的体内多成分协同关系及其药动学特征，探索其配伍内涵的物质基础；拟采用DILI动物模型，观察二至丸及其多成分的保肝协同作用，建立时-量-效关系模型和成分-分布-效应关系模型，探索其配伍内涵的保肝协同作用；从整体、器官、细胞、分子水平，研究二至丸抑制或阻抗DILI的炎性反应和调节机体免疫系统紊乱的作用机制，探索其保肝的多靶点整合协同作用机制。本研究结果对于阐明二至丸防治DILI的物质基础及作用机理具有重要实用价值，为临床应用提供科学依据；对于探索方剂配伍内涵具有重要的理论意义和科学价值。

目的：研究二至丸体内效应成分的协同保肝作用机制。方法：从整体、器官、细胞、分子等水平，分析二至丸体内效应成分的协同保肝作用机制。结果：⑴ 明确了二至丸在大鼠体内的多种效应成分红景天苷、特女贞苷、蟛蜞菊内酯。⑵ 完成了二至丸保肝作用的时-量-效关系研究，明确了二至丸具有急性肝损伤保护作用，最佳的给药剂量为400 mg/kg，且在造模24h后发挥最大药效。⑶ 二至丸组分拆方研究发现，女贞总苷提取物能够显著降低肝损伤小鼠肝脏组织中MDA含量，同时提高SOD、GSH-Px两种抗氧化酶活性；蟛蜞菊内酯提取物能够显著抑制小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6三种炎症因子水平。⑷ 研究二至丸主要效应成分对CCl4致小鼠急性肝损伤模型的多靶点保肝作用机制，发现蟛蜞菊内酯能够抑制CCl4引起炎症相关蛋白COX-2和i NOS 表达上调，降低ERK磷酸化以及NF-κB 细胞质转移至细胞核，增加JNK磷酸化；同时，能够使Bax 及 active Caspase-3 表达明显减少，Bcl-2 表达显著增加。特女贞苷能够明显降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px活力，同时，能够提升肝细胞核Nrf2及GCLC、HO-1、NQO1的蛋白表达，这些抗氧化物降低了肝脏细胞中氧化自由基。⑸ 研究二至丸体内主要效应成分体外肝细胞损伤的保护作用，发现蟛蜞菊内酯可减少细胞内ROS的释放，使Nrf2的表达由细胞质向细胞核转移明显增加，且HO-1和GCLC表达均升高，进一步研究发现蟛蜞菊内酯在体外能够刺激ERK、JNK磷酸化。结论：二至丸主要有效成分蟛蜞菊内酯和特女贞苷具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等多靶点协同保肝作用：蟛蜞菊内酯发挥保肝作用机制可能与其抑制NF-κB由细胞质向细胞核转移、ERK磷酸化、增加JNK磷酸化的抗炎作用，以及上调Bcl-2和下调Bax及caspase3的抗凋亡主要而有关；蟛蜞菊内酯在体外对H2O2所致肝细胞氧化损伤具有明显的保护作用，提高细胞生存率，其作用机制可能为通过ERK、JNK通路调节Nrf2，进而调节HO-1/GCLC的表达，从而发挥对肝细胞损伤的保护作用。特女贞苷能够激活肝细胞Nrf2通路，通过调节Nrf2及其下游的GCLC、HO-1、NQO1表达发挥抗氧化作用，减轻CCl4引起的氧化性肝损伤。