珍稀濒危植物掌叶木性别分化的分子机制研究

Handeliodendron bodinieri is the first-class national wild conservative plants and endangered tree species at the border area between Guangxi province and Guizhou province in China. This plant has extensive application value in bio-energy, landscaping and water and soil conservation fields. It not only has hermaphroditic flowers with functional stamen and pistil but also has unisexual flowers with aborted stamen and pistil in dioecious trees. Due to the unique feature of flowers in Handeliodendron bodinieri, they can be used as perfect materials to study sex differentiation and unisexual flower development in tree species. To elucidate the molecular mechanism of pistil or stamen abortion underlying sex differentiation from transcriptomic and proteomic aspects in Handeliodendron bodinieri, we plan to use abnormal pistil and stamen before and after abortion in unisexual flowers and normal pistil and stamen in hermaphroditic flowers at the same stage as control material. Firstly, the stage of pistil or stamen abortion will be determined using paraffin section technique combine with Transmission Electron Microscope (TEM) through detecting their cytological characteristics. Secondly, key proteins that controlling pistil or stamen abortion will be identified using Two-Dimensional Fluorescence Difference In Gel Electrophoresis (2D-DIGE) technique. Thirdly, key genes regulating pistil or stamen abortion will be identified using RNA-seq technique. Finally, these genes will be cloned and their function involved in sex differentiation will be characterized in Arabidopsis thaliana. Therefore, these information will provide theoretical foundation for the conservation, breeding, scientific research and application of Handeliodendron bodinieri.

掌叶木是我国广西与贵州交界处特有的国家Ⅰ级保护野生珍稀濒危植物，是一种优良的生物质能源、园林绿化和水土保持树种，具有广阔的开发利用价值。前期研究结果表明其花既有功能正常的两性花，也有雌雄蕊选择性败育形成的雌雄异株的单性花，是探索木本植物性别分化及单性花发育分子机制的良好材料。因此，本课题拟以掌叶木选择性败育前后的雌花或雄花与同时期正常发育的两性花为材料，采用石蜡切片、透射电镜等技术比较分析雌雄蕊选择性败育的细胞形态特征，确定雌雄蕊选择性败育可能的关键时期，然后通过荧光差异双向电泳结合蛋白质谱分析寻找选择性败育形成的关键蛋白；同时利用RNA-seq技术进行转录组分析，寻找并克隆雌雄蕊选择性败育形成的关键基因，最后利用模式植物拟南芥进行功能鉴定，探讨关键基因在控制性别分化中的作用；以期从蛋白组和转录组水平揭示掌叶木单性花性别决定中雌雄蕊选择性败育的分子调控机理，为其保育与科学研究利用奠定基础。

掌叶木是我国广西与贵州交界处特有的国家Ⅰ级保护野生珍稀濒危植物，是一种优良的生物质能源、园林绿化和水土保持树种，具有广阔的开发利用潜力。为揭示掌叶木花性分化机制，本课题从掌叶木不同性别花发育过程中生理生化变化及转录组和蛋白组差异等方面研究了不同时期、不同性别花的差异，从蛋白组和转录组水平揭示了掌叶木单性花性别决定中雌雄蕊选择性败育的分子调控机理，为其保育与科学研究利用奠定良好基础。研究表明：（1）掌叶木属单全异株植物，其植株多为花芽发育初期雌雄蕊都正常，后期雌蕊或雄蕊选择性败育形成的雄株或雌株，也偶见雌雄蕊都不败育的正常两性花植株，自然居群内雄株数＞雌株数＞两性株数。（2）掌叶木的雄花和雌花早期雌雄蕊原基分化正常，但随着进一步发育，雌花中雄蕊败育，败育的时间发生在小孢子母细胞向四分体分化的过程中，小孢子不能正常形成。而雌蕊败育差异较大，最终胚胎不能正常形成。（3）掌叶木雌花雄蕊或雄花雌蕊选择性败育与其生理生化代谢相关，表现为败育早期SOD、POD、CAT活性以及可溶性蛋白、可溶性糖含量均高于败育晚期，说明败育晚期的自由基水平可能更高，膜脂的过氧化程度更严重，影响蛋白质和糖的输送。（4）以两性花为对照，通过对掌叶木雌花和雄花成花过程中蛋白质 iTRAQ 的定量检测结果表明，雌花和雄花从零时期到形成单性花的过程中都有特异表达的蛋白产生，其中雌花成花过程中共产生差异蛋白5175个，上调蛋白2685个，下调蛋白2490个；雄花成花过程中共产生差异蛋白5167个，上调蛋白2593个，下调蛋白2574个。（5）RNA-seq技术进行转录组分析结果表明：与掌叶木雄花雌蕊败育的相关基因共135个，54类，其中上调基因60个，下调基因75个，包括FCA、KCID、FPA、Y4837、FH14、GIGAN、PINI等基因家族类基因。与掌叶木雌花雄蕊败育的相关基因共126个，52类，其中上调基因59个，下调基因67个，包括FCA、GPAT6、KC1D、GIGAN、FPA等基因家族基因。（6）建立了掌叶木体胚培养体系，可为掌叶木性别分化基因验证奠定良好基础。