靶向肝脏CREB/CRTC2的抗糖尿病活性物质及作用机制研究

As one of the major features of type 2 diabetes, fasting hyperglycemia is mainly caused by the overproduction of glucose from the liver through accelerated gluconeogenesis. cAMP/ CREB (cAMP-response-element binding protein) dependent signaling cascade is critical for the transcriptional activation of hepatic gluconeogenic gene. As a pivotal CREB co-activator, CRTC2 (cAMP-regulated transcriptional-coactivator) is able to dramatically enhance CREB activity and involved in multiple CREB regulated physiological events. The pathophysiological function and regulatory mechanism of CRTC2 have also been well established in the last decade. Briefly, glucagon induces cAMP-mediated dephosphorylation of CRTC2, which leading to its nuclear translocation and subsequent activation of gluconeogenic gene expression. Insulin is responsible for the inactivation of this process by degrading CRTC2 under feeding conditions. Several studies confirm that CREB/CRTC2 is a new identified therapy target for type 2 diabetes. However, few studies focused on the screen of CREB/CRTC2 inhibitors. The efficacy and safety of Chinese traditional medicines in the treatment of type 2 diabetes are well known. Therefore, basing on the molecular basis of CREB/CRTC2 regulating gluconeogenesis, we will establish a new drug screen system to find natural selective CREB/CRTC2 inhibitor from Chinese traditional medicines, such as propolis, Rehmannia glutinosa (Dihuang) et al., and then test their effects on glucose metabolism and explore the underlying mechanism. This proposed research project will provide new leads to develop antidiabetic drugs.

持续高血糖是糖尿病的重要特点和诊断主要依据，肝糖异生亢进是造成2型糖尿病高血糖症的源发性原因之一，因此通过抑制肝糖异生亢进降血糖是糖尿病治疗中一个重要手段。目前研究成果已证实cAMP-PKA-CREB/CRTC2调控机制在肝糖异生信号转导中的核心地位、是血糖控制的一个全新靶点，但靶向CRTC2信号转导调节剂的系统研究极少。传统中药有多靶点的优势，多种临床有效、低毒的天然降糖药物（如蜂胶、地黄、黄连等)中极有可能蕴藏着靶向CREB/CRTC2通路的调节剂。本项目将利用已探明的CREB/CRTC2作用机制，采用多层次（分子、细胞及动物整体）与多手段（双报告基因、活体定位、活体成像等）相结合的方法对降血糖天然产物以及小分子化合物进行筛选，以期发现靶向CREB/CRTC2介导的肝糖异生的抑制剂，并阐明其在不同水平上作用的分子机理，为开发具有自主知识产权的靶向肝糖异生的新型降糖药物奠定基础。

多项研究已经证实CRTC2这一穿梭蛋白质以丰富的修饰方式与多个信号通路相互联系在转录调控中发挥重要的作用。因此CREB/CRTC2转录复合体是一个全新的降糖靶点。为了研发新型抗糖尿病药物，本项目以CREB/CRTC2转录调控肝糖异生功能为理论基础，通过建立筛选方法、检测体系，并在整体水平进行验证，旨在发现通过靶向抑制cAMP-CREB/CRTC2转录调控机制的小分子抑制剂，研究这一类小分子对肝糖异生及整体血糖的调控作用，为开发具有自主知识产权的全新靶点的抗糖尿病新型药物奠定基础。本项目通过原代肝细胞双报告基因系统（G6P-LUC 及RSV-Renilla），对多中中药组分进行了筛选，初步试验中发现巴西蜂胶能有效抑制G6P-LUC 报告基因的转录活性，进而抑制肝原代细胞的肝糖异生关键酶基因转录，从而显著降低肝原代细胞的葡萄糖输出，这些活性与巴西蜂胶增强肥胖小鼠的葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性有直接关系。为了找到巴西蜂胶中最有效的降血糖成分，我们通过活性追踪对巴西蜂胶进行了定向组分分离（上海药物所胡立宏团队完成），获得约20个蜂胶成分。通过靶向CREB与CRTC2相互结合的哺乳动物双杂交系统筛选检测这些化合物的抑制活性，结果表明巴西蜂胶单体中多个结构类似物具有抑制CREB与CRTC2相互结合的活性，其中APC，Artepillin C，抑制活性最强。蛋白质水平及胞内免疫沉淀实验证明Artepillin 能抑制CREB与CRTC2的结合,降低肝细胞的糖异生水平，减少肝细胞的葡萄糖输出量,且细胞毒性低。活体实验证明，Artepillin C（20mg/kg）能显著地降低高脂诱导糖尿病模型小鼠（DIO）活体肝组织的肝糖异生水平及关键酶PEPCK的mRNA水平及蛋白质水平。在整体水平上，Artepillin C 显著降低糖尿病模型小鼠（db/db以及DIO ）的饥饿血糖、改善糖尿病小鼠的葡萄糖代谢平衡及胰岛素敏感性。因此Artepillin C 是一个新型抗糖尿病药物先导化合物。本项目首次发现了Artepillin C 为代表的一类小分子抑制剂，通过与CREB直接结合，从而抑制CREB/CRTC2的转录活性，是基础理论研究导向的转化医学研究的一次具体体现。项目研究成果正在申请专利一项，学术论文1篇在审，培养硕士研究生一名（已毕业)。