基于鳖甲功效的先导化合物的发现研究

鳖甲为临床常用中药，具有滋阴潜阳，软坚散结，退热除湿的功效，其物质基础文献报道为游离氨基酸和微量元素。课题组在"十五"攻关子课题鳖甲炮制工艺规范化研究的基础上发现，其主要功效成分为寡肽类而非游离氨基酸类。本课题拟利用各种化学分析分离手段及波谱学鉴定技术，对其功效成分鳖甲寡肽类进行系统地分离和鉴定，利用液相或固相肽合成技术对单体寡肽类成分进行全合成和结构改造，利用鸡胚绒毛尿囊膜模型（CAM模型）、大鼠CCL4肝纤维化模型及家兔发热模型对单体寡肽类成分及其结构改造物进行活性筛选，结合计算机辅助药物设计并进一步优化寡肽结构，以揭示鳖甲功效的物质基础，寻找抗肝纤维化的寡肽类先导化合物。

背景：鳖甲及其制剂临床可防治肝细胞损害、改善肝功能和抑制肝纤维化的形成,但鳖甲功效成分尚不清楚；前期实验发现，鳖甲主要功效成分为寡肽类而非游离氨基酸类；中药中天然寡肽类成分的分布广、应用前景广阔，但中药中寡肽类化学成分因分离分析难度大，研究较少。.方向：中药有效物质基础研究项下中药寡肽类活性成分的研究.主要内容：1.鳖甲寡肽类成分的分离、纯化、分析、结构测定、结构修饰研究——采用离子交换色谱、凝胶色谱、C18色谱等方法对鳖甲提取物中寡肽成分进行分离纯化；应用双缩脲法、HPLC、HPLC-MS等方法对鳖甲寡肽类成分进行了检识和分析；应用氨基酸序列测定仪、1D-NMR、2D-NMR、HRMS对鳖甲寡肽单体成分进行结构鉴定；应用固相合成法对鳖甲寡肽单体成分进行全合成；应用拼合化学对鳖甲寡肽单体成分进行结构修饰；.2.鳖甲寡肽类成分的保肝及抗肝纤维化活性筛选和活性评价研究——应用细胞模型(小鼠巨噬细胞、小鼠淋巴细胞、噬碱性粒细胞、肝胚胎细胞、肝星状细胞、人肌成纤维细胞、人肝癌细胞等)、组织蛋白结合模型、酶学筛选模型(单胺氧化酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶)、CAM模型对鳖甲寡肽类成分进行活性筛选，应用CCL4及酒精诱导小鼠急性肝损伤模型、CCL4及酒精诱导大鼠慢性肝损伤模型、猪血清诱导的大鼠肝纤维化模型对鳖甲寡肽单体进行了活性评价。.重要结果：基于鳖甲功效发现了寡肽先导化合物（鳖甲七肽）；评价了该化合物的活性,发现其对免疫相关细胞具有促进增殖活性，对肝星状细胞增殖有一定抑制作用；对酒精诱导的正常肝细胞损伤有预防及治疗作用；体外与肝组织蛋白有一定结合；对单胺氧化酶有一定抑制作用，而对透明质酸酶、弹性蛋白酶具有一定的促进作用；对CCL4和酒精诱导的急、慢性肝损伤模型、猪血清诱导的大鼠肝纤维化模型均具有一定的保护作用；建立了双缩脲-酶联免疫测定法快速检测鳖甲中的肽类成分；制备了专用于某些寡肽类成分（含特殊氨基酸）的分离和分析硫酸铜-硅胶络合吸附剂； .关键数据：鳖甲寡肽先导化合物氨基酸序列为GAGPHGG.科学意义：揭示了鳖甲功效的物质基础，为鳖甲及其制剂的质量控制提供依据；筛选了保肝及抗肝纤维化的寡肽先导化合物——鳖甲七肽，课题研究方法对其它中药寡肽类成分的研究具有一定借鉴意义。