糖尿病视网膜病变中CLIC4对视网膜色素上皮细胞VEGF合成与分泌的作用

Overproduction of vascular endothelial growth factor(VEGF) is essential to the development of proliferative diabetic retinopathy(PDR), Anti-VEGF strategy shed new light on PDR treatment, but it has side effect due to physiological function blockage of VEGF. A better understanding of endogenous VEGF basic biology is crutial to PDR treatment. VEGF is primarily synthesized by retinal pigment epithelium(RPE) intraocularly. Chloride intracellular channel 4(CLIC4) is a protein involved in membrane trafficking, signaling regulation and angiogenesi. We found that CLIC4 is down-regulated in RPE under high-glucose environment, while CLIC4-knockout RPE has increased intracellular VEGF immunoreactivity, CLIC4- knockout mice develops retinal vessel leakage and neovascularization-like lesions reminiscent of PDR. We hypothesize that down-regulated CLIC4 in High glucose environment causes overexpression and/or improper trafficking and secretion of VEGF in RPE, hence induces neovascularization and PDR. Two specific aims are proposed to further study the role of CLIC4 on RPE-derived VEGF in diabetic retinopathy: 1. Correlation of CLIC4 and VEGF expression in high glucose environment；2. Effect of CLIC4 on VEGF expression, trafficking and secretion in RPE. Completion of these specific aims will elucidate the role of CLIC4 in PDR, further our insights on mechanism of endogenous VEGF trafficking and secretion, and provide us a new perspective for PDR pathogenesis research and therapeutic strategy.

血管内皮生长因子（VEGF）增高在增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）的发生发展中起关键作用，视网膜色素上皮细胞（RPE）是眼内VEGF最重要的来源，深入研究RPE源性VEGF的基本生物学特性及其调控十分必要。CLIC4蛋白参与膜转运、信号调节、血管生成，我们发现高糖时RPE中CLIC4下调； CLIC4敲除的RPE内VEGF信号增强，CLIC4敲除鼠有类似PDR中VEGF增高所致的表型。因此，高糖环境下RPE中CLIC4的下调很可能使VEGF表达升高和/或分泌异常、促进视网膜新生血管和PDR的发生。本研究拟利用RPE原位转染和可诱导Cre-Lox系统等技术，从分子、细胞和整体（动物和人体）水平探讨高糖环境下CLIC4与VEGF表达的关系，并在体内、体外分别阐明CLIC4对RPE内VEGF表达、转运与分泌的作用，从而揭示CLIC4对PDR发病的作用，为PDR治疗提供新视角。

经过多次、仔细的重复实验，本研究发现高糖环境下人RPE细胞ARPE-19中CLIC4 的mRNA及蛋白表达均为上调；虽与原假说不符，但与新近文献中RPE细胞在光化学损伤时及胰腺β细胞在炎症状态下CLCI4的表达趋势相同；而在高脂饮食诱导的2型糖尿病及STZ诱导的1型糖尿病小鼠RPE/脉络膜复合物组织中，CLIC4表达出非常复杂的变化趋势。为研究CLIC4 在RPE细胞中的确切作用，以shRNA构建了CLIC4敲除的RPE，表达下调70%左右。发现：CLIC4敲低后RPE内VEGF 免疫荧光信号明显增强，且其蛋白的表达也有所上升；而RPE-19细胞中VEGF的几个亚型里，以VEGF165亚型为主且与总VEGF呈现良好的平行关系变化，而VEGF121等其他亚型由于浓度极低因而变化并无显著性差异；推测高糖环境下RPE 中CLIC4 的上调可能与总VEGF及VEGF165表达升高和/或分泌异常相关，因而在促进视网膜新生血管和PDR 的发生中有一定作用；为验证细胞内外VEGF浓度分布的规律，以transwell实验收集细胞培养基进行的VEGF ELISA测定结果未获得稳定可信的趋势，但在这个过程中我们发现CLIC4沉默组RPE细胞比control的迁移能力明显下降，推测高糖激活的CLIC4表达可能影响RPE细胞的迁移和侵袭能力，而有文献报道CLIC4可与TGF-β互相作用造成细胞的EMT改变，于是课题组决定探索CLIC4对细胞迁移能力及其相关因子表达的影响。结果发现划痕实验显示，24小时后细胞迁移的能力CLIC4组RPE细胞较Control组明显降低，与transwell实验的结果吻合，同时CLIC4的RPE细胞TIMP1和TIMP2的表达上升，符合我们对CLIC4对细胞迁移过程起促进作用的假设，但与此同时si-CLIC4的RPE中 MMP2似乎也有轻微上升但并无表现出显著性，因此CLIC4在这个细胞外基质调控网络中各个因子的表达的调控作用尚不完全明确。由于CLIC4分子在细胞内的作用极其复杂，包括膜转运、信号调节、血管生成、细胞周期调控等，其在糖尿病视网膜病变这样一个病理生理机制复杂的疾病中的作用需要进一步研究来阐明。