HCN4基因修饰iPS细胞源性Tbx18+心外膜祖细胞定向诱导分化心脏起搏细胞的实验研究

构建心脏生物起搏点是治疗缓慢性心律失常疾病的研究前沿。"量身定做"无免疫排斥反应、纯化的起搏细胞是该领域研究的难点。自体诱导多能干细胞(iPSC)是"生产"起搏细胞的最佳"种子细胞"。HCN4和Tbx18对窦房结（SAN）起搏细胞分化形成起关键作用。早期胚胎HCN4+ 心脏祖细胞（CPCs）与 Tbx18+ 心外膜祖细胞（EPCs）存在不同区域，当两者相互渗透，SAN起搏细胞就开始分化形成。因此我们提出假说：HCN4与Tbx18相互作用是SAN起搏细胞定向分化的关键机制。本课题利用HCN4基因转染iPSC源性Tbx18+ EPCs，筛选出Tbx18+/HCN4+CPCs，采用RNAi技术，建立对照组：Tbx18-/HCN4+、Tbx18+/HCN4-CPCs。通过检测其诱导分化出的细胞是否具备起搏细胞的特性来验证假说。有望建立利用自体皮肤成纤维细胞"量身定做"纯化的起搏细胞的实验方法。

摘要.心脏生物起搏器的研究可能具有重要的临床应用价值。但是，目前科学家们尚未发现一种生产生物起搏器的最佳种子细胞。本课题最初提出假说：Tbx18+EPCs可能是再生心脏起搏细胞的最佳种子细胞，而HCN4基因修饰IPS源性Tbx18+EPCs可能是生产生物起搏器的最可行途径之一。为证实以上假说，本课题从以下四个方面进行了研究：（1）为从胚胎发育角度揭示心脏起搏细胞的起源，我们建立了胚胎心脏发育研究平台及相关研究方法；（2）为在技术性角度可靠的解决示踪转录因子Tbx18的分化命运难题，我们建立两种双杂合基因敲入小鼠模型-Tbx18+心脏祖细胞命运示踪模型Tbx18 -Cre/Rosa 26R LacZ / EYFP。（3）利用示踪模型研究心脏前体心外膜祖细胞的分化命运及心脏起搏细胞的来源。（4）对Tbx18+EPCs分化为心脏起搏细胞的机制进行了初步探讨。主要研究成果及进展情况包括以下6部分：（1）建立利用模式小鼠研究胚胎心脏发育的研究平台；优化建立一管酒精法提取基因组的实验方法，利于简便、高效的鉴定转基因小鼠。建立创新性的整胚和整体器官原位杂交技术。(2)我们繁殖鉴定的Tbx18-Cre基因敲入小鼠和报告基因小鼠保真性良好，遗传性状稳定。（3）成功建立Tbx18+心脏祖细胞示踪模型。（4）利用示踪模型揭示Tbx18+EPCs在小鼠心脏发育形成中扮演重要角色。（5）示踪模型揭示Tbx18+EPCs可分化形成心脏起搏细胞，因此Tbx18+EPCs可能是再生心脏起搏细胞的最佳种子细胞，Tbx18在心脏起搏细胞再生研究中可能起重要作用。（6）我们也进一步对Tbx18+EPCs分化形成心脏起搏细胞的分子机制进行了初步研究。综上所述，本课题初步验证假说：Tbx18+EPCs可能是再生心脏起搏细胞的最佳种子细胞。其分化机制及最可行的构建生物起搏器的技术策略尚需更深入的研究。