发状念珠藻高通量转录组分析及耐旱相关基因的克隆与功能研究

Nostoc flagelliforme is one species of terrestrial cyanophyte with high economic value. It is distributed in arid or semiarid steppes of the west-northern of China. For its high economic value and tolerance in extreme environment, it is signifcant to study on resistance mechanism of N. flagelliforme. The transcriptome sequencing technology based on the Illumina/Solexa high-throughput sequencing platforms can detect the overall transcription of any species at the single-nucleotide level, and analyze the structure of transcriptions and gene expression levels. In this study, transcriptomes of N. flagelliforme at the stages of growth under water stress will be sequenced using Illumina/Solexa sequencing technology. Screening and cloning desiccation-tolerane related genes through transcriptome analysis. qRT-PCR, promoter sequence analysis, prokaryotic expression and overexpressing Arabidopsis will be performed. It is helpful to elucidate the desiccation-tolerane molecular mechanisms of N. flagelliforme.

发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)是一种陆生蓝藻，分布于我国西北部的干旱半干早地区。由于其较高的经济价值，以及生活在极端环境下所具有的抗逆性，深入开展发菜抗逆生物学的研究有着重要的理论和实际意义。基于 Illumina/Solexa 高通量测序平台的转录组测序技术能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录情况进行检测，分析转录本结构及基因表达水平。本研究拟以发状念珠藻为研究对象，应用 Illumina/Solexa 高通量测序技术对干旱胁迫下不同时期发状念珠藻细胞进行转录组分析，从中筛选并克隆耐旱相关基因。通过qRT-PCR、启动子分析、原核表达和转拟南芥等研究，明确耐旱相关基因的功能，从而从分子水平阐明发状念珠藻干旱胁迫过程中的耐旱机制。

发状念珠藻是一种具有极强耐旱性的陆生蓝藻，不仅具有较高的营养价值和药用价值，还对维护生态环境有重要意义，近年来关于发状念珠藻的耐旱机理的研究备受关注。本研究采用模拟干旱胁迫的方法处理液体悬浮培养的发状念珠藻，研究干旱胁迫下发状念珠藻生理特性的变化。应用 Illumina/Solexa 高通量测序技术对干旱胁迫下不同时期发状念珠藻细胞进行转录组分析，从中筛选并克隆耐旱相关基因。通过qRT-PCR、启动子分析、原核表达和转烟草等研究，明确耐旱相关基因的功能，从而从分子水平阐明发状念珠藻干旱胁迫过程中的耐旱机制。所得主要结论如下：.（1）采用高通量测序技术，组装了发状念珠藻基因组精细图，对水分胁迫下不同生长时期发状念珠藻转录组进行分析，找出发状念珠藻的耐旱相关基因。.（2）采用PCR技术从发状念珠藻细胞中克隆了过氧化物还原酶（Prx）、谷胱甘肽还原酶（Gr）和氧化还原酶（Ox）基因，并运用生物信息学软件对基因序列进行分析。结果表明，发状念珠藻prx基因编码的蛋白是定位在细胞质中的亲水性蛋白，不具有信号肽和卷曲螺旋结构，较高稳定性较高；gr编码的蛋白是存在与细胞质中的亲水性跨膜蛋白，不具有卷曲螺旋结构和信号肽，具有较高的稳定性；ox基因编码的蛋白是定位在细胞质中的不稳定蛋白，无跨膜结构域，有卷曲螺旋结构，不分泌信号肽。这一结果为进一步研究耐旱相关基因在发状念珠藻抗逆过程中的机理提供信息参考。.（3）采用实时荧光定量PCR技术检测prx、gr、ox基因表达情况，结果显示干旱胁迫下prx、gr、ox基因均上调表达，说明prx、gr、ox基因参与了发状念珠藻干旱胁迫的应答，是发状念珠藻对干旱胁迫的一种抗性反应。.（4）利用易错PCR对发状念珠蓝细菌水分胁迫蛋白（WSP）进行改造，优选出的wsp1与wsp2为模板，对已经改造的WSP蛋白进行家族改组，以期构建出具有较高耐旱能力的wsp基因。.（5）构建原核表达载体转化大肠杆菌，并筛选鉴定了转化菌株的耐干旱生存能力。构建植物过量表达载体，采用农杆菌介导法转化烟草，对阳性转基因植株进行耐旱性检测，分析分子改造后wsp基因的耐旱性。