gI和gE对鸭瘟病毒衣壳蛋白、囊膜糖蛋白沿神经元轴突顺向运输的影响

Similar to several other alphaherpesviruses, duck enteritis virus (DEV) is neurotropism and could infect host's nervous system and become latent. Under appropriate conditions, the latent viruses could be reactivated and its progeny virus could be transported from neuron soma to peripheral nerve endings or central nervous system, thus result in recurrent infections. At present, there are no reports about transmission routes of neuropathology or viral proteins related to neurovirulence of DEV. In several alphaherpesviruses, gI and gE have been reported to be closely related to their transport in neurons, as well as neurovirulence. To elucidate the effect of gI and gE on anterograde transport of DEV capsid and glycoprotein in neurons, this study will be carried out by constructing and screening a "two-color" DEV recombinant expressing a fluorescent glycoprotein and capsid by "two-step Red recombination" method based on the established infectious clone of DEV strain. Next, based on the obtained "two-color" DEV recombinant, gI and gE single and double-gene deleted recombinant viruses will be constructed, and biological characteristics of these viruses on neurons will be analyzed. Finally, the effect of DEV gI and gE on axon anterograde transport of viral proteins will be evaluated. This study will be useful for understanding long-distance axonal transport of DEV and elucidating molecular mechanism of virus reactivation from latency.

与多种α-疱疹病毒一样，鸭瘟病毒具有神经嗜性，能在宿主神经系统中建立潜伏感染。在适宜条件下， 病毒被激活，其子代病毒粒子可从神经细胞体向外周神经末梢或中枢神经系统方向传播，引起复发性感染。目前未见有关DEV神经病理传导路线及神经毒力相关蛋白等方面的报道。gI、gE与多种α-疱疹病毒在神经细胞中的运输及神经毒力密切相关，为了阐明DEV gI、gE在神经细胞中对其衣壳蛋白和囊膜糖蛋白沿轴突顺向运输的影响，本研究拟在DEV全长感染性克隆的基础上，利用“Red E/T两步重组”技术，构建同时对衣壳蛋白和囊膜糖蛋白进行荧光蛋白标记的重组病毒，之后在该“双色”重组病毒基础上，构建gI、gE单基因和双基因缺失的重组病毒，通过研究这些重组病毒在神经细胞中的生物学特性，最终阐明gI、gE对病毒蛋白在神经元中顺向轴突运输的影响。本研究将有助于了解病毒蛋白在轴突中长距离运输的方式及病毒从潜伏状态活化的分子机制。

在鸭瘟病毒（DEV）感染性克隆基础上，通过Red E/T介导的两步重组法依次将红色荧光蛋白（mRFP）和青色荧光蛋白（CFP）基因分别克隆至DEV基因组gC基因C末端、UL35基因 C末端，构建了一株同时携带gC-mRFP和VP26-CFP的重组鸭瘟突变体克隆pVP26CFP-gCRFP，并拯救获得了双色荧光蛋白标记的重组病毒rVP26CFP-gCRFP。Western blot分析表明病毒感染细胞中，VP26-CFP和gC-mRFP都以融合蛋白形式存在，亚细胞定位研究表明gC-mRFP在病毒感染早期（36h，48h）定位于整个细胞，感染60h大部分迁移至细胞质；而VP26-CFP定位于细胞核。TEM观察表明，在病毒感染细胞中，都能观察到不同形式的病毒粒子（A衣壳，B衣壳，C衣壳）。该病毒的获得为进一步研究DEV病毒蛋白的运输、病毒组装及病毒-宿主的相互作用等提供了良好的技术平台；构建了两株单荧光标记的重组病毒rgCRFP和rVP26CFP， 利用荧光探针，采用Co-IP和MS-MS联用方法从宿主细胞中分别调取了DEV gC和VP26互作蛋白21个和30个。采用酵母双杂交和双分子荧光互补试验验证了gC能与7个宿主蛋白（GNG2、PPP2CA、UBE2I、AR1H1、NUBP1、MCM5和HN1）互作，该研究为探讨gC生物学功能、病毒的致病机理和抗病毒药物的研发提供了线索；构建了DEV gG缺失病毒rDEV-∆G，对rDEV-ΔgG和rDEV-EF1感染细胞样品进行转录组分析，结果显示rDEV-ΔgG与rDEV-EF1相比，有3402个基因上调，2827个基因下调。差异基因主要集中于糖脂代谢、能量生成和代谢、炎症免疫与趋化和离子转运。该研究初步探讨了gG的生物学功能。在项目的资助下，发表论文2篇，SCI论文1篇，中文一级核心论文1篇。授权专利1项。还有1篇SCI论文修回。