缺氧诱导胞核EGFR磷酸化NONO促进DNA修复在肿瘤放疗抵抗中的作用及机制

We have proved that hypoxia environment enhances tumor radio-resistance by interfering autophagy and apoptosis associated pathways. However, blocking all these pathways only partially inhibited radio-resistance, indicating that other pathways are involved in. Through genome-wide knockout library screening, we found that NONO, a DNA damage repair gene, was involved in hypoxia-induced tumor radio-resistance. We have proved that nuclear EGFR (nEGFR) promotes radio-resistance, and nEGFR is associated with and phosphorylates NONO in nucleus. Moreover, NONO was reported to be associated with XLF to enhance the ligation of damaged DNA. Therefore, we hypothesized that: nEGFR interacted with and phosphorylated NONO, enhancing the association between NONO and XLF, therefore promoted DNA damage repair and tumor radio-resistance. This project will apply some advanced technic, including site mutation, gene knockout and 3D cell culture, and animal models and clinical research, to disclose the mechanism underlying HIF-1α--EGFR--NONO--XLF--radio-resistance, and highlight this pathway as a novel target for radiotherapy sensitization.

我们已证实缺氧通过自噬及凋亡途径促进肿瘤放疗抵抗，然而阻断上述通路仅能部分实现放疗增敏（Autophagy及EJC，第一作者），提示存在其他调控通路！基于基因敲除文库，我们在全基因组水平进行筛选及验证，鉴定出DNA损伤修复基因NONO参与缺氧诱导的放疗抵抗，并证实胞膜EGFR核内移可促进放疗抵抗，预实验发现核EGFR可结合并磷酸化NONO，促进放疗抵抗。已知NONO可与XLF结合促进断裂DNA的接合。由此，我们提出缺氧诱导肿瘤放疗抵抗的新机制：核EGFR磷酸化NONO，增强NONO与XLF的结合，促进DNA损伤修复，导致放疗抵抗。本项目拟通过基因编辑及三维培养等方法，鉴定出核EGFR磷酸化NONO的具体位点，明确其结合XLF促进DNA损伤修复的机理，藉由动物模型及临床验证，最终阐明缺氧时核EGFR磷酸化NONO，增强NONO与XLF的结合，促进断裂DNA的损伤修复，诱导肿瘤放疗抵抗的机制。

放射治疗是实体肿瘤治疗的主要手段之一。乏氧环境是肿瘤放疗抵抗的重要原因，其具体机制尚不完全明了。在前期研究中，我们利用全基因组敲除文库发现DNA损伤修复基因NONO参与了缺氧诱导的肿瘤放疗抵抗。在本项目的支持下，我们系统地研究了NONO在调控DNA损伤修复及放疗抵抗中的作用机制，发现：1) 鉴定明确了PRMT1介导的NONO精氨酸甲基化修饰位点是R251，后者是NONO促进肿瘤生长、转移等功能所必须的（Oncogene，2021）; 2) 放疗可诱导肿瘤细胞中NONO蛋白发生液液相分离，招募了EGFR与DNA修复关键蛋白DNAPK，促进DNA损伤诱导的DNA-PK磷酸化激活，最终导致肿瘤放疗抗性增强（Am J Cancer Res，2021）；3) NONO相分离可招募RPLP0，促进DNA损伤修复关键激酶DNA-PK的磷酸化激活，增强DNA修复与肿瘤放疗抵抗（Cell Death Dis，2022）。在项目实施过程中，我们发现液液相分离在DNA损伤修复中起重要作用，并系统筛选了具有液液相分离特性的DNA损伤修复蛋白，发现：4) 包含MRNIP以内的多个DNA修复相关蛋白具有相变能力，MRNIP可在细胞核内发生液液相分离形成液态的无膜细胞器，招募并浓缩MRN复合物，当DNA损伤发生时，MRNIP液滴快速移动至DNA损伤位点，增强MRN复合物与损伤DNA的结合，加快ATM的磷酸化激活，进而促进HR介导的DNA损伤修复与肿瘤放疗抵抗（Nat Commun，2022）。上述系列成果揭示了肿瘤放疗抵抗的分子机制，为肿瘤临床放疗增敏提供了新的靶点，为临床治疗提供新思路。在本项目的支持下，项目负责人获得了2022年度国家杰出青年基金，本项目第一参与人获得了2023年度广东省自然科学基金-杰出青年项目。..