RhoA在猪脂肪间充质干细胞成脂分化早期的作用研究

畜禽体内脂肪的合理沉积，可增加风味，改善胴体品质。由脂肪组织中提取分离的脂肪间充质干细胞（AMSCs）在体外培养并进行成脂诱导分化时，形态会发生巨大变化（由长梭形转变为充满脂滴的圆形），而RhoA作为联系细胞骨架与膜表面受体的关键蛋白和一种细胞信号转导中介子，在此过程中的作用尚不清楚，因此本课题拟在前期研究基础上，检测RhoA在分化早期的时序表达和活性变化情况，再分别通过持续激活和抑制RhoA及其下游信号分子来探索其在猪AMSCs成脂分化早期中的作用，并初步研究RhoA与TGF-β信号通路中的Smad蛋白的关系，同时拟采用miRNA芯片法筛选及应用实时 RT-PCR技术确定AMSCs成脂分化早期受RhoA调控的miRNAs，用生物信息学方法分析miRNAs基因的启动子元件、鉴定表达调控转录因子和作用的靶基因，为有效调控畜禽脂肪沉积或人类肥胖相关疾病的治疗和预防提供新的理论参考和靶点。

Rho/Rho激酶信号通路是体内普遍存在的一条信号转导通路，它通过调节细胞内肌动蛋白的骨架的聚合状态，参与多种细胞功能，包括细胞收缩、迁移、黏附、增殖、凋亡、及基因表达等。RhoA 本质上是一种GTP 酶，通过与GTP 和GDP 结合方式的转换发挥调控下游信号分子的开关作用。本项目在培养间充质干细胞并诱导成脂分化的基础上，研究此通路在间充质干细胞成脂分化中的作用机制：1、发现RhoA表达量在细胞成脂诱导的前7天呈先升高后降低趋势。用Rho激酶抑制剂Y-27632和盐酸法舒地尔（HA1077）处理后，均能够显著抑制C3H10T1/2细胞的增殖，但在抑制成脂分化方面，表现不一致，Y-27632处理，可抑制成脂分化相关基因的表达；而HA1077却有一定的促成脂分化作用；2、Rho激酶抑制剂Y-27632和盐酸法苏地尔（HA1077）对AMSCs细胞冻存的保护作用不尽相同。二者处理冻存细胞后，均可提高细胞的冷冻复苏率，但是HA1077处理复苏后的细胞，形态更好。3、在前期实验的基础上，本课题组还发明了一种医学研究实验鼠类的心脏穿刺取血装置及其穿刺取血方法（已获专利，ZL201410013716.5），同时总结出一种体外细胞接触式共培养装置及其培养操作方法，一种体外细胞触式共培养装置及其培养操作方法（ZL201410386234.4），同时探索了微波辅助SDS-PAGE胶检测蛋白的染色方法（发表论文1篇）。4、以秀丽隐杆线虫为模型，研究发现罗勒和亳菊提取物对线虫的脂肪代谢有一定的影响；益母草水提物也可明显抑制小鼠前体脂肪细胞的体外增殖，但是否与Rho/ROCK 信号通路相关，需要进一步的实验研究。综上所述，Rho/ROCK 信号通路与细胞骨架蛋白actin在脂肪细胞成脂分化方面表现出一定的调控作用，这为下一步研究细胞形态与转录因子作用奠定了基础，也为有效调控畜禽脂肪沉积提供了新的思路和作用靶点。