深黄被孢霉高产花生四烯酸功能基因的筛选及分子机理研究

花生四烯酸具有广泛的生物活性和重要的保健功能。发酵法生产花生四烯酸易形成大规模生产，是制备花生四烯酸的良好途径。国内外研究主要集中在高产花生四烯酸的菌种选育及发酵调控等方面，利用基因工程技术对花生四烯酸合成代谢途径进行有针对性的、定向的调控，成为发酵法生产花生四烯酸技术的关键。本项目拟以花生四烯酸产生菌深黄被孢霉作为研究对象，利用抑制消减杂交技术构建不同花生四烯酸产量的深黄被孢霉消减cDNA文库，采用反向斑点杂交技术对该文库进行差异表达基因的筛选和鉴定，并对筛选的差异表达未知基因进行功能分析，同时对花生四烯酸合成途经中的功能基因表达模式进行研究，从而获得不同花生四烯酸产量的深黄被孢霉基因表达变化的信息，在此基础上探明深黄被孢霉高产花生四烯酸的分子机理，为进一步对菌株进行代谢途径的改造提供科学依据，为大幅度提高花生四烯酸发酵生产水平提供理论参考。

本项目按照计划书中的要求开展了工作，已完成各项研究内容和目标，具体情况如下：（1）以深黄被孢霉3.3410为出发菌株，采用紫外诱变原生质体方法进行花生四烯酸高产菌株的筛选，确定原生质体制备条件和紫外诱变剂量。利用气相色谱分析突变株的ARA含量，突变株YZ-124的ARA产量最高，为4.72 g/L，其ARA产量比原始菌株As3.3410提高576%，并且遗传性能稳定。（2）采用抑制消减杂交技术，以深黄被孢霉原始菌株和高产ARA诱变菌株为试验材料构建消减cDNA文库，挑取430个克隆进行PCR筛选，获得388个阳性克隆。（3）采用斑点杂交对消减cDNA文库的阳性克隆进一步筛选，获得113条表达序列标签（ESTs），其中59条ESTs序列为数据库中的已知基因， 54条ESTs为未知基因。将已知ESTs序列进行GO功能分类分析发现，28个基因参与生物学功能，31个基因与分子功能相关。（4）采用荧光定量PCR方法比较不同ARA产量的5株深黄被孢霉的7 d培养物和YZ-124的3～8 d培养物的△5、△6-脱饱和酶基因的mRNA转录表达水平及其ARA产量，结果表明：△5、△6-脱饱和酶基因的mRNA表达量与培养物油脂中ARA含量具有一定的相关性。（5） 将pREDi通过PEG/CaCl2原生质体转化法转入到深黄被孢霉高产ARA菌株中进行表达，构建了△5、△6-脱饱和酶和UG1的RNA干扰载体pRed△5i、pRed△6i和pRedUG1i。（6）利用实时荧光定量PCR方法检测RNA干扰效果，比较目标基因的敲减率和ARA产量，发现△5、△6-脱饱和酶影响深黄被孢霉生产ARA，而未知基因UG1对ARA的产量没有影响。（7）利用RT-PCR和基因克隆的方法获得了5株深黄被孢霉的△5、△6-脱饱和酶基因的完整cDNA，对其进行序列比对分析，发现深黄被孢霉诱变菌株的核苷酸序列与原始菌株相比有少数突变，而氨基酸序列同源性相对较低，且诱变菌株的蛋白质结构发生了一定程度的变化。以上实验结果证实深黄被孢霉生产ARA的过程中有很多基因的表达量发生显著变化，获得了不同ARA产量的深黄被孢霉的功能基因表达变化的信息，研究成果为进一步对菌株进行代谢途径的改造提供科学依据，为大幅度提高ARA发酵生产水平提供理论参考。