结核分枝杆菌β-螺旋蛋白Rv1057参与ESAT-6分泌的分子机制及其表达调控

ESAT-6 is a virulence factor secreted by ESX-1 secretion system in Mycobacterium tuberculosis (MTB), but it is still unclear how ESAT-6 to across the outer membrane. Rv1057 encodes a putative β-propeller protein, which might function as a transport protein. Our preliminary studies imply that Rv1057 might be involved in the secretion of ESAT-6. So we hypotheses that Rv1057 may be a new member of ESX-1 system, and is responsible for outer membrane transportation of ESAT-6. In this study, we will first generate a Rv1057 mutant strain, thereby determine its role in EAST-6 secretion; Next the location of Rv1057, the interaction of Rv1057 with the other relative protein and cell components would be investigated; Then, the regulators and their binding sites on Rv1057 will be analyzed, macrophage model with MTB infection would be performed to clarify the integrated regulation of expression of Rv1057, secretion of ESAT-6 and the virulence of MTB by these regulators. This study will be helpful to reveal the complete secretion mechanism of ESX-1 and provide a theoretical basis for new recombinant vaccine development.

ESAT-6是结核菌的毒力因子，由ESX-1系统分泌到体外，但ESAT-6的跨膜运输机制仍然未知。序列分析表明Rv1057编码β-螺旋蛋白，可能是结核菌的外膜运输蛋白。我们的前期研究结果提示Rv1057可能参与ESAT-6分泌，因此，我们假设Rv1057可能是ESX-1系统的新成员，参与ESAT-6的外膜运输。本研究拟：（1）构建Rv1057基因突变菌株，明确Rv1057在ESAT-6分泌中的作用；（2）定位Rv1057在细胞中的位置，分析Rv1057与结核菌组分、相关蛋白之间的相互作用；（3）分析Rv1057的调控因子及其结合位点，通过MTB感染巨噬细胞实验明确这些调控因子对Rv1057表达、ESAT-6分泌和菌株毒性的协同调控作用。此项研究将最终阐明Rv1057是否是ESX-1的成员及其作用机制。研究结果有助于揭示完整的ESAT-6分泌机制，为开发新型结核病重组疫苗提供理论依据。

结核菌是肺结核病的病原菌，统计表明我国现有近5.5亿的结核菌感染人群，每年新发100万例结核病病人。分泌蛋白ESAT-6和CFP-10是结核菌的一类重要的致病因子，由ESX-1 分泌系统排出胞外，但ESX-1的分泌机制尚未完全阐明。本项目通过研究发现Rv1057可以影响ESX-1分泌功能和结核菌的毒性，可能是参与结核菌运输的细胞膜蛋白。..项目通过试验证实缺失Rv1057 会影响ESAT-6和其他ESX-1系统底物蛋白的分泌，而且ESAT-6被累积在细胞膜上，说明缺失Rv1057影响ESX-1 系统的正常功能。Rv1057则被定位为细胞膜蛋白，蛋白质相互作用分析表明其与PPE52 蛋白、PPE68蛋白之间具有相互作用，说明Rv1057可能通过PPE蛋白发挥功能。Lsr2蛋白是新发现的Rv1057转录调控蛋白，综合分析已知的MprA和TrcR调控蛋白，最终阐明了Rv1057表达的调控机制：Lsr2和TrcR都是Rv1057的阻遏调控蛋白，MprA是激活调控蛋白；在结核菌生长早期，TrcR结合Rv1057启动子并阻碍Rv1057的转录，当受到环境条件压力后MprA激活Rv1057的转录并阻遏TrcR表达，而随着时间的延长结核菌开始表达Lsr2并阻遏Rv1057的表达。巨噬细胞感染实验显示缺失Rv1057蛋白会显著降低结核菌在巨噬细胞中的增殖速度。在感染初期巨噬细胞中IL-1β、IL-10和TNF-α的表达量显著降低，而IL-4和IL-8的表达量没有显著差异，此外巨噬细胞释放LDH活性显著降低，而胞内NO浓度显著升高，说明缺失Rv1057蛋白还会显著降低结核菌的毒性。 ..研究结果表明Rv1057是一个重要的细胞膜蛋白，可能通过与PPE蛋白的相互作用参与ESAT-6 分泌过程。研究结果对于揭示完整的ESAT-6 分泌机制具有重要的科学意义，有助于增进对结核菌致病性的了解，并可能为结核病治疗提供新的靶点。.