芥菜型油菜转录因子BjuA.TT8基因上游调控因子的分离和鉴定

Flavonoids as the secondary metabolites play a crucial role in colour changing process of flower, leaf, fruit and seed. In Brassica juncea, BjuTT8 gene is the key regulator of seed coat color formation and is also involved in the flavonoid biosynthesis in different tissues. However, it is still unclear what gene(s) regulate the expression of the BjuTT8 gene in Brassica juncea. In this project, we will construct a set of 5’ and 3’-end deletion fragments expression vectors of BjuA.TT8 gene promoter for identification of the functional element regulation of BjuA.TT8 gene expression in different tissues. Yeast one hybrid assay will be used to uncover specific regulation of BjuA.TT8 gene expression of upstream regulation factors. Then, qPCR technology will be applied to detection of the expression of these upstream regulation factors in the different tissues. After all, all the results will preliminary analysis of the function of these upstream regulation factors, further elaborated of regulatory network of BjuA.TT8 gene involved in the biosynthetic pathway and reveal regulation mechanism of expression of the BjuA.TT8 gene in different tissues, which will provide theoretical foundations for different color of flower, leaf and seed of new varieties breeding in Brassica juncea.

类黄酮物质在植物花、叶、果实和种子颜色变化的过程中起着至关重要的作用。在芥菜型油菜中，BjuTT8基因是调控种皮颜色形成的关键基因并且也参与不同组织部位中类黄酮物质合成。但是该基因的表达受什么基因的调控机制目前在芥菜型油菜还未见报道。本研究通过采用对芥菜型油菜BjuA.TT8基因启动子的5’端和3’端缺失技术鉴定调控BjuA.TT8基因在不同组织部位中表达的作用元件，利用酵母单杂交等技术鉴定调控BjuA.TT8基因在不同组织部位中特异表达的上游调控因子；利用qPCR技术检测上游调控因子基因在芥菜型油菜不同组织部位的表达，初步解析这些基因的功能；进一步阐述BjuA.TT8参与类黄酮物质形成的调控网络及其在不同组织部位表达的调控机制，为培育不同色泽的花，叶和种子的芥菜型油菜新品种奠定理论基础。

在芥菜型油菜中，BjuTT8基因是参与不同组织调控类黄酮合成关键基因。但是该基因的表达受什么基因的调控机制目前在芥菜型油菜还未见报道。本研究通过采用对芥菜型油菜BjuA.TT8基因启动子的5’端缺失技术鉴定BjuA.TT8基因的表达模式；利用酵母单杂交技术筛选调控BjuA.TT8基因上游调控因子；利用qPCR技术检测与BjuA.TT8基因互作蛋白基因在芥菜型油菜不同组织部位的表达；通过构建互作蛋白基因的过表达载体转化拟南芥初步鉴定基因的功能。研究结果发现：BjuA.TT8基因的在茎、叶、花柄、花药、花柱、角果皮和种子中均有表达，而且调控该基因的在茎叶表达的启动子作用元件位于-1212bp~612bp处；利用酵母单杂交技术筛选调控BjuA.TT8基因上游调控因子31个，涉及光调节的捕光叶绿素a/b结合蛋白cp29.2，蛋白质积累的锌金属蛋白酶egy2，谷胱甘肽S-转移酶蛋白GSTF9等以及一些未知功能蛋白；其中5号蛋白编码的基因可能在黑籽材料中具有表达特异性，7号蛋白，17号蛋白和27号蛋白编码的基因在所分析的组织中都是黑籽材料高于黄籽材料表达；构建了30号蛋白基因（具有bHLH蛋白结构）的过表达载体转化拟南芥，转基因拟南芥的子叶颜色呈紫色，且与类黄酮合成相关的AtTT8，AtDFR和AtANS基因等基因表达显著提高。本研究获得了调控BjuA.TT8基因上游调控因子，为进一步阐述BjuA.TT8参与类黄酮物质形成的调控网络奠定了基础。