基于多肽阵列技术的芪归银方延缓耐药物质基础及作用机制研究

近年来，滥用抗生素引起的多重耐药铜绿假单胞菌感染发病率和死亡率居高不下，已严重威胁患者生命，给医院有效抗感染治疗带来极大困扰，由于其耐药途径多，耐药机制复杂，目前缺乏临床可用特效药物，急需研究疗效确切、作用机理及物质基础清楚新型药物。中药在细菌耐药的防治中发挥重要作用，但成分复杂、物质基础不明确。多肽阵列是后基因时代揭示各种疾病和生化现象的最直接研究技术，通过对含药血清进行致病蛋白与耐药蛋白的完整抗体谱的检测，可发现与药物抗耐药菌机制相关新型抗体与抗原决定族。本课题以临床疗效确切的芪归银方为研究载体，利用先进的多肽阵列技术和β-内酰胺酶机制研究等经典方法相结合，研究其延缓/逆转铜绿假单胞菌耐药作用机制。同时利用多肽阵列技术和LC-MS等技术从方中筛选活性组分并进行表征，明确其药效物质基础。本课题对于临床防治耐药菌（如铜绿假单胞菌）具有深远意义，同时为研究细菌耐药作用机制及药物筛选提供新思路

本课题采用多肽阵列技术结合经典的β-内酰胺酶机制研究方法，对芪归银方延缓/逆转铜绿假单胞菌耐药作用机制和物质基础进行了研究，获得以下主要结果：1.芪归银方含药血清体外干预铜绿假单胞菌诱导耐药过程，可以延缓机体对亚胺培南耐药出现的时间（平均约晚2代）；对于多重耐药铜绿假单胞菌，芪归银方含药血清可以在一定程度上恢复其对亚胺培南的敏感性。2.采用经典方法探讨芪归银方延缓/逆转多重耐药作用机制，初步明确了芪归银方含药血清可以降低多重耐药铜绿假单胞菌中β-内酰胺酶的水解速率，并对铜绿假单胞菌的膜通道蛋白OprD有一定的保护作用。3.从耐药蛋白的血清抗体变化角度，用多肽阵列技术进行分析，结果提示芪归银方可以增强机体针对耐药蛋白的抗体反应，提高药物对细菌的敏感性，并发现了芪归银方治疗耐药菌感染的关键抗原蛋白（PBP3、Exotoxin A及TEM）及抗体识别位点；同时筛选出多糖、黄酮类成分具有较好的活性。4.采用HPLC-ESI-LTQ-Orbitrap技术对芪归银原药以及含药血清中的化学成分进行了较为系统的分析，初步明确了芪归银方延缓铜绿假单胞菌耐药的药效物质基础。上述研究结果表明，芪归银方中的多糖、黄酮类成分具有较强的延缓/逆转多重耐药铜绿假单胞菌耐药的作用，其主要通过降低β-内酰胺酶的水解速率、对铜绿假单胞菌的膜通道蛋白OprD的保护及增强机体针对耐药蛋白的抗体反应发挥作用。上述研究结果基本完成了课题预期研究目标。