羟基磷灰石纳米粒子干扰癌细胞钙稳态引发凋亡的分子机制

Cancer is one of the most formidable diseases in human health. It is a global, and as yet unsolved, challenge to develop more effective and safer cures for this disease. In our previous studies, it has been found that hydroxyapatite nanoparticles (HAPNs) can selectively inhibit cancer cell growth through mitochondrial-dependent apoptosis, and the HAPNs cytotoxicity is related to the amplitude of cytosolic Ca2+ increase. Based on the above new phenomena, considering the calcium–apoptosis link and the remodeling of Ca2+ signal in tumorigenesis, we hereby propose a hypothesis that calcium overload plays an important role in selective cytotoxicity of HAPNs to cancer cells. To test this hypothesis, we design an innovative strategy to investigate the involved novel mechanism: both transient and long-term calcium overload caused by HAPNs treatment will be considered, Ca2+ signal remodelling will be identified in cancer cells before and after nanoparticle treatment. In this project, the Ca2+ increases will be characterized in the spatial and temporal resolution, the calcium source leading to cytosolic Ca2+ rise will be identified, Ca2+ signal remodelling in cancer cells and it’s relation to selective cytotoxicity will be analyzed, and the pathways associated with intracellular Ca2+ overload that lead to apoptosis in cancer cells upon HAPNs treatment will be explored. Therefore, the mechanism responsible for apoptosis through perturbation of intracellular Ca2+ homeostasis induced by HAPNs in cancer cells will be described. These results will provide new opportunity to develop more effective and specific cancer therapy with HAPNs, may create a potential to regulate cell activities through Ca2+ signaling in various cells, and will add new knowledge to so-far-limited understanding of nanoparticle-biological interaction.

研发高效、安全的癌症治疗方法是全球关注的重大课题。在前期探索羟基磷灰石纳米粒子（HAPNs）选择性引发癌细胞凋亡机理时发现，粒子毒性与其引发胞内钙离子浓度升高程度呈现相关性。基于此新现象，结合钙超载可激活和调控多种形式细胞死亡，及肿瘤发生发展过程中存在钙信号重构特征，本项目提出假设：钙超载是HAPNs选择性引发癌细胞凋亡的重要原因。由此提出创新性研究策略：兼顾粒子瞬时和长效作用，基于解码肿瘤细胞内钙信号重构特征考察粒子扰动效果，研究钙介导的选择性癌细胞毒性新机制。通过解析HAPNs引发胞内钙超载的时空变化规律，辨识胞内超载钙来源，分析肿瘤细胞钙信号重构特征及其对粒子选择性毒性的影响，探索钙介导死亡途径，阐明HAPNs干扰钙稳态引发癌细胞凋亡的作用机制。结果可指导基于HAPNs的高特异性抗肿瘤新技术开发，为利用纳米粒子改变钙信号调控不同细胞的功能提供可能，并可丰富纳米生物效应的科学新内涵。

羟基磷灰石是生物硬组织的主要无机成分，具有良好的生物相容性，是一种广泛使用的生物材料。有趣的是，近年来的研究发现，羟基磷灰石纳米粒子（HAPNs）能选择性抑制不同肿瘤细胞生长，引发肿瘤细胞凋亡。对于HAPNs选择性抗肿瘤活性的机理，已发现粒子能引发肿瘤细胞内钙离子浓度升高，发生钙超载。在此基础上，本项目提出HAPNs引发钙超载导致肿瘤细胞凋亡的假设，从导致肿瘤细胞凋亡的原因、钙超载来源及其引发细胞凋亡的途径开展研究，取得以下重要结果：.第一，HAPNs引起的胞内钙超载是导致其抗肿瘤活性的重要原因。采用不同毒性的粒子，以及不同的肿瘤细胞，均发现粒子所引发的细胞毒性和胞内钙超载的程度正相关，而胞内钙螯合剂BAPTA-AM 则可在一定程度缓解钙超载和粒子毒性。第二，粒子在肿瘤细胞内降解、抑制质膜钙泵（PMCA）活性和钙离子外排，导致了肿瘤细胞内的钙超载。粒子可在胞外溶液中可降解，与细胞接触后也会引发胞内Ca2+浓度瞬时升高，但均对肿瘤细胞活性无影响；TEM观察和茜素红染色均发现进入肿瘤细胞内的HAPNs更快降解；粒子作用仅使得肿瘤细胞内PMCA活性降低，但抑制PMCA 活性后HAPNs 可引发正常细胞中的Ca2+水平和细胞毒性升高。第三，钙超载激活钙蛋白酶（calpain）引发线粒体凋亡途径。粒子作用引发线粒体中出现最为明显的钙超载，活化的钙蛋白酶可进一步切割Bid 蛋白，介导Cyt C 从线粒体的释放以及caspase-9 和caspase-3 的激活，引发线粒体途径凋亡，而钙蛋白酶抑制剂则可逆转凋亡。第四，粒子形貌和分散性的控制。控制反应温度，可通过微乳液法与溶剂热联用法合成不同形貌和大小的HAPNs；采用聚谷氨酸为模板进行原位沉积构建聚谷氨酸/羟基磷灰石纳米颗粒，可提高表面电荷促进粒子分散；合成后的粒子可吸附血清，更稳定地保持分散状态，促进细胞摄取和抗肿瘤活性。第五，HAPNs 负载化疗药物有效克服肿瘤细胞多药耐药性（MDR）。纳米粒子可有效负载阿霉素，并抑制MDR乳腺癌细胞MCF-7/ADR中药物泵的外排作用，提高胞内药物浓度，通过粒子与药物的协同作用，使得IC50值降至游离药物的1/150，在荷瘤小鼠体内完全抑制耐药肿瘤细胞生长，并消除了药物所引发的心脏毒性和肝脏损伤。.研究结果对于深入认识肿瘤细胞特性具有重要的科学意义，也有助于开发高效、安全的抗癌药物。