水稻柱头长度QTL qSTL3的图位克隆及其功能分析及制种应用评价

Rice stigma length was high significantly correlated with percentage of exserted stigma(PES), while PES played an important role in hybrid rice seed production. By fine mapping, map-based cloning and predicting candidate genes for qSTL3, a stigma length-conditioning QTL detected in our early research, was finely mapped. Then, its cadidate genes were predicted by searching against the related rice genome annotation database. On this basis, through detecting the expression characteristics of candidate genes by semi-quantitative RT-PCR, combined with sequencing results of cDNA and genome DNA of candidate genes, qSTL3 gene will be confirmed. Plant transformation vector will be constructed and transgenic function confirmation will be done for qSTL3. Temporal and spatial expression of qSTL3 in tissues and organs will be analyzed using near-isogenic lines and transgenic offsprings. The mechanism of qSTL3 on exserted stigma will be elucidated by applying bioinformatics methods according to the sequencing results. The evolution of alleles at qSTL3 locus and its relationship with domestication of rice will be studied by investigating and analyzing the allelic polymorphism at qSTL3 locus in 542 accessions of cultivated rice and wild rice collected from different geographic origin.The application value of qSTL3 in hybrid seed production will be evaluated according to the frequencies of plants with purple leaf in the F1 populations obtained by crossing the transgenic and non-transgenic materials with pollen parent with dominant purple leaf trait.

水稻柱头长度是影响不育系繁殖与制种产量的重要性状。本申请项目拟在前期对柱头长度QTL qSTL3精细定位和候选基因分析的在基础上，通过半定量RT-PCR分析，结合候选基因的cDNA测序，确定qSTL3基因；构建qSTL3的植物转化载体，进行转基因互补验证；利用近等基因系和转基因后代分析qSTL3在组织器官中的时空表达；根据测序数据，结合生物信息学分析，阐明qSTL3的作用机理。调查不同地理来源水稻542份种质qSTL3位点等位基因多态性，分析qSTL3等位基因的演变规律。利用具有显性的紫色叶片性状的品种为父本，与转基因和非转基因材料相间种植，根据F1代中紫叶出现频率，评价qSTL3的繁殖制种利用价值。

水稻杂种优势利用是提高水稻单产最有效的途径之一。杂交水稻需要年年生产一代杂种种子。柱头长度是影响杂交稻种子单产的一个重要因素。然而，调控柱头长度的分子机制仍然不清楚。我们构建了qSTL3候选基因的互补载体和过表达载体，并分别遗传转化日本晴和SSSL14愈伤组织，最终获得互补和过表达转基因阳性植株。通过对转基因阳性单株的表型鉴定，确定候选基因Loc_Os03g14850就是STL3。我们构建了突变型启动子+GUS融合蛋白载体转化日本晴，并发现所有检测的组织中都有GUS信号。通过qRT-PCR发现，STL3-k 在花序分化8期的幼穗和雌蕊中有最高的表达量。我们构建了qSTL3基因与荧光报告基因RFP融合蛋白并最终定位STL3蛋白在细胞核中。我们通过酵母单杂试验，确定转录因子的调控核心区域。组织压片试验结果表明双亲柱头长度的差异是细胞长度不同引起的。我们测定日本晴和SSSL14材料柱头组织的内源激素GA4，BR和IAA含量，发现日本晴和SSSL14之间的激素BR和IAA含量无差异，GA4含量有显著差异。在幼穗分化3-4期，涂抹GA3溶液后，发现该植株的柱头非毛刷部分长度增加，而毛刷部分长度不变；涂抹BR和IAA，植株的柱头非毛刷部分和毛刷部分长度没有变化。我们选取赤霉素合成途径上的关键基因进行qRT-PCR，表明STL3-k通过上调GA生物合成基因OSCPS1、OSKS2、OSKO2、OSKAO和OsGA3OX2的表达导致了GA4的增加。为进一步评价qSTL3的制种利用潜力，我们用7001SSTL3-k和对照7001SSTL3-n作母本，籼稻恢复系9311作父本。组合7001SSTL3-n×9311的F1异交结实率为37.4%，明显低于组合7001SSTL3-k×9311的结实率57.4%。7001SSTL3-k×9311组合的1平方米实收种子产量为581.07g，而7001SSTL3-n×9311组合1平方米的种子产量为501.98g，前者比后者增加了16%。这些结果说明，利用STL3-k等位基因可以显著提高不育系的制种产量。本研究的结果为后续从遗传上永久性改良异交性状提供理论基础；同时，研究过程中产生的创新材料，可应用于改良不育系的异交性状。