核桃内生真菌多样性及活性菌株发酵产物抑菌机理研究

With long history of cultivation and widely distribution, walnut is a better material for the study of endophytic fungi. Preliminary study of the project team found that walnut endogenous fungal metabolites have good antibacterial and allelopathic effects. However, the endogenous fungal is different between different tissue in walnut, and it may change in different climate, season. The biodiversity of endogenous fungal in walnut and the type, structure, mechanism of active substances in metabolites is eager to further research. We plan to get different parts from healthy walnut of different climatic conditions (the subtropics, warm temperate zone and temperate zone) in Shaanxi Province during different seasons as samples, separate endophytic fungi using different disinfection methods, and find out the endogenous fungal biodiversity by the morphological identification and ITS rDNA-RFLP. We hope to get 2-4 high activity bacteriostasis strains through activity tracking and 3-5 active compounds by optimizing culture and purification. We hope to reveal the antibacterial mechanism of the active ingredient initially through research on the mode of action of active materials, plant morphology, cytological, physiological and biochemical changes by activity bioassay, pot experiment and other methods. The results not only provide a new theory for pesticide activity of walnut secondary metabolites and its endophytes, but also explore new research ideas to control pest using the endophytic fungi from walnut. It is also important to promote the stability and coordinated development of agroforest ecosystems.

核桃因栽培历史悠久、分布广泛是研究内生真菌的较好材料。项目组前期研究发现，核桃内生真菌的代谢产物具有较好的抑菌和化感作用。但不同气候、季节、组织中核桃内生真菌的生物多样性，发酵产物中抑菌物质种类、结构及作用机理急待深入研究。本项目拟在不同季节从陕西境内亚热带、暖温带和温带不同环境下核桃健康植株的不同部位采样，并采取不同消毒方式进行内生真菌分离，运用形态鉴定与ITS rDNA-RFLP的分子标记方法明确其生物多样性；在活性跟踪下，筛选出抑菌活性菌株2-4株，优化培养条件并分离纯化活性化合物3-5个；采用活性生测、盆栽试验等手段，通过对活性物质的作用方式、受体植物形态学、组织细胞学和生理生化指标变化的研究，揭示活性成分的抑菌机理。研究成果不仅可为核桃及其内生真菌农用活性研究提供新理论，也为核桃内生真菌用于有害生物防治开拓新的研究思路，对促进农林生态系统稳定、有序、协调发展具有重要意义。

核桃因栽培历史悠久、分布广泛是研究内生真菌的较好材料。本研究在不同季节从陕西境内亚热带、暖温带和温带不同环境下核桃健康植株的不同部位采样，并采取不同消毒方式进行内生真菌分离，运用形态鉴定与ITS rDNA-RFLP的分子标记方法明确其生物多样性；在活性跟踪下，筛选出抑菌活性菌株，优化培养条件并分离纯化活性化合物；采用活性生测、离体试验、组织细胞学等研究，揭示活性成分的抑菌机理。并运用代谢组学分析目标菌株的生物活性物质。主要研究结果如下： .1. 从核桃组织中分离出隶属于65个属的2485株内生真菌，其中交链孢霉属（Alternaria）内生真菌为绝对优势菌属。核桃内生真菌在一年中呈现‘秋盛春衰’周期性动态变化的规律。.2. 通过拮抗试验从176株核桃内生真菌中筛选得到了具有显著抗菌活性的LTL-G3等11个菌株，同时发现辣椒疫霉和番茄早疫两种病原菌更适合作为其拮抗指示菌。发酵液抑菌试验表明，LTL-G3（ Fusarium camptoceras）、YJL-3（Trichoderma）和YJL-14（Drechslera）菌株为高活性菌株。.3. 抑菌试验表明，LTL-G3的乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物的抑菌活性最好；浓度为10 mg/mL时，对苹果腐烂（Valsa ceratosperma）、小麦赤霉（Fusarium graminearum）病原菌的抑制率都达到100%。以小麦赤霉为敏感病原菌，优化LTL-G3发酵条件，最优发酵条件为：8%接种量、摇瓶转速150 r/min、发酵4 d。优化工艺获得的发酵液，其对小麦赤霉病原菌的抑制率提高了6.2%。.4. 对LTL-G3发酵产物的代谢组学分析，检测到17个类别的307种化合物，化合物数量最多的物质类别是黄酮类化合物、氨基酸及其衍生物和脂质；相对含量最高的是氨基酸及其衍生物、植物激素和核苷酸及其衍生物；推测LTL-G3菌株发酵代谢产物中的活性物质可能为水杨酸、苦皮藤碱和阿魏酰尸胺。.5. 活性菌株YJL-3代谢产物的乙酸乙脂萃取物，经多次层析、薄层制备及重结晶等分离纯化，得到11个化合物，确定化合物A为3β-羟基-5α-胆甾烷，化合物油B为油酸。活性菌株YJL-14发酵液的乙酸乙脂萃取物，在活性跟踪下，以层析、重结晶等分离手段得到两个化合物，化合物1确定为胆固醇。