果蝇力感受纤毛细胞中“微管高级结构”的动态性及微管调节蛋白DCX-EMAP的作用

In fly mechanosensory cells, the cilia-based microtubule cytoskeleton possesses multiple functions, such as cell scaffold, transportation track and mediating mechanotransduction. Intuitively, these microtubule cytoskeleton are non-centroid microtubules and their formation and dynamics are tightly regulated by microtubule-associated proteins (MAPs), both in time and in space. In our previous work, we screened a set of MAPs which are specially expressed in fly mechanosensory cells. Although several MAPs have been found to regulate dynamical properties of microtubules, their molecular basis and working mechanism in cilia-based microtubule formation are still unknown. In present proposal, we will focus on the DCX-EMAP, a conserved protein critical for mechanotransduction. Using microtubule assembly assay, live-cell imaging and electron tomography technique, we will study the regulation of microtubule growth and catastrophe by DCX-EMAP as well as the differences of turnover rate and three-dimensional structure of the cilia-based microtubule cytoskeleton between wild type and DCX-EMAP mutants, which will provide insight into understanding the function of this molecule in microtubule turnover. This proposal will establish a solid basis for further studying the formation and dynamics of cilia-based microtubule cytoskeleton.

在果蝇力感受细胞中，基于纤毛的微管高级结构具有细胞支架、运输轨道及介导力信号转导等生理功能。直观来说，这些微管高级结构包含的都是非中心体微管，它们的发生及动态性是一个在时间和空间上被微管相关蛋白高度调节的细胞生物学过程。在前期工作中，我们利用基因芯片和RNA-Seq技术，筛选出一批在果蝇力感受细胞中特有的微管相关蛋白编码基因。其中很多分子对微管动力学具有调节作用，但这些蛋白在微管高级结构形成中的工作机制及其分子基础是未知的。本项目将利用体外微管重组、活细胞成像和电子断层成像等技术对其中一个重要蛋白分子DCX-EMAP进行系统研究，重点解析该蛋白对体外微管重组过程中表观参数的影响以及该蛋白功能缺失突变体中微管高级结构周转速率及精细三维结构的变化，从而充分了解该蛋白在微管高级结构周转过程中的功能。本项目的实施将为研究微管高级结构的发生及动态性打下坚实的基础。

果蝇力感受神经元树突远端的“微管高级结构”不仅起到了细胞支架、细胞内物质运输轨道的作用，还具有直接参与细胞内信号转导的功能。该“微管高级结构”的形成是由微管动态性决定的。在前期的工作中，我们利用基因芯片和RNA-Seq技术，筛选出一批在果蝇力感受神经元中特有的微管相关蛋白编码基因。其中很多分子对微管动力学具有调节作用。据此，本项目将重点对其中一个分子DCX-EMAP进行系统的研究，帮助我们理解该蛋白调节微管动力学的分子基础以及其在微管高级结构形成过程中的功能。本项目首先利用电子断层成像技术重建了果蝇力感受神经元树突远端的三维结构。可以看到，树突远端为特化初级纤毛，包括基体、纤毛、管状体（Tubular body，TB）和力感受器（Mechanoreceptive organelle，MO）等。通过计算机辅助计算，追踪了特化初级纤毛内部的所有微管，发现整个“微管高级结构”包含很多非中心体微管，主要分为两个阵列：TB中较大的微管阵列和MO中较小的微管阵列。活细胞成像表明这些微管的正端朝向树突的远端，而且漂白后能够恢复，大约3小时可以恢复到漂白前的25%左右。通过对DCX-EMAP及其截短突变体定位分析表明，DCX-EMAP主要富集在力感受细胞的MO内；WD40截短突变体不能定位在树突远端，推断WD40结构域可能和细胞内定位功能有关。FIB/SEM结果表明，该蛋白敲除突变体中，MO中的微管阵列消失，微管数目剧减，但TB中微管阵列没有明显变化。进一步体外微管动力学实验表明，DCX结构域能够通过降低回缩速度、增加挽救频率来帮助微管稳定。因此，我们初步推断，DCX-EMAP通过稳定微管来促进MO中短微管的存在。总之，本项目提供了“微管高级结构”形成的机制，推动这一研究领域的前沿发展，也为进一步解析相关细胞生物学过程的分子机制打开了大门。