钾离子通道介导的内源性电场微环境与唇腭裂发生的相关性研究

The environmental and genetic factors were considered to contribute to the etiology of cleft lip and palate. Majority of the cases was associated without other congenital malformation, which suggested us that the pathogenesy of cleft lip and palate may be only the change of localized microenvironment. To investigate the relationship between localized microenvironment and the etiology of cleft lip and palate, based on the theories of endogenous electric fields and left-right asymmetric development, we will establish the craniofacial deformity chicken and palatine process fusional disturbance mice models through the methods of adding converse acoustic pulse electric fields or the conductive capillary allowed currents leak out of the embryo, and the inhibitor of potassium ion channels to disturb endogenous electric fields. We will detect the change of susceptive genes spatio-temporal expression. At the same time, we will investigate the change of mesochymal and epithelial cells behavior under electric fields. From the view of electrophysiology, we expect to interpret the role of localized microenvironment-endogenous electric fields contributed to the etiology of cleft lip and palate.

先天性唇腭裂公认的发病机制是遗传与环境因素共同作用所致。大多数唇腭裂的发生不伴有其他先天畸形，提示可能仅仅为发病过程中局限性微环境改变所致。为研究唇腭裂发病过程中微环境因素导致易感基因时空表达变化特征，本项目基于内源性电场及左右非对称性发育理论，选取鸡胚和小鼠胚胎作为研究对象，分别采用附加脉冲电场和导电电极引导离子外渗，改变内源性电场环境；同时采用钾离子通道抑制剂诱导电场及局部微环境改变，建立颅颌面畸形鸡胚动物模型和小鼠腭胚突融合障碍发育模型。对唇腭裂易感基因时空表达变化进行检测。同时对腭胚突间充质细胞及上皮细胞在电场环境中细胞行为改变进行研究。从电生理角度探讨内源性电场调控的胚胎细胞微环境与唇腭裂相关性，以阐明局限性微环境-内源性电场在唇腭裂发病过程中的作用机理，为唇腭裂发病机理理论积累资料，最终为预防唇腭裂的发生提供理论依据。

先天性唇腭裂（口面裂）被认为是一种多基因遗传性疾病，其公认的发病机制是遗传与环境因素共同作用所致。遗传因素的研究因多基因疾病存在遗传异质性，导致不同遗传背景人群研究结果不一致。环境因素研究方面，外源性环境因素作用于母体最终亦是通过改变胎儿发育过程中局限性微环境而导致先天畸形的发生。内源性电场作为胚胎发育过程中重要的微环境因素，其在腭发育过程中是否存在及其具体作用，目前尚未明确。本项目从遗传和内源性电场微环境两方面入手，通过PCR-RFLP、t检验、ANOVA、卡方检验和meta分析检测MTHFD1基因单核苷多态性（SNP）与中国人群唇腭裂的相关关系。发现MTHFD1基因1958G>A位点A等位基因与唇腭裂发生相关联。同时，通过腭胚突器官培养、免疫组织化学染色、膜电位敏感荧光染色及激光共聚焦显微成像等技术检测腭发育不同阶段内源性电场时空变化特征。选择前期研究显示参与内源性电场形成的重要因素-Na+-K+-ATPase通道蛋白作为靶点，其通道抑制剂干扰内源性电场后，腭胚突形态和腭裂相关蛋白TGFβ3表达变化，结果证实：腭发育关键时期均存在内源性电场作用，其分布存在不同时空变化特征。垂直期的电位强度：口腔侧上皮>中嵴上皮>鼻腔侧上皮；上抬期的电位强度：中嵴上皮>鼻腔侧上皮>口腔侧上皮；粘附期的电位强度：口腔侧上皮>鼻腔侧上皮>中嵴上皮；融合期的电位强度：口腔侧上皮>鼻腔侧上皮。干扰该电场后，腭胚突形态和腭裂相关蛋白TGFβ3表达发生相应变化。腭胚突形态细长、尖锐， 但腭板仍能接触融合。腭胚突内TGFβ3的表达在上抬期时异常。腭胚突内TGFβ3在口腔侧上皮、鼻腔侧上皮、中嵴上皮均呈强阳性表达，间充质中少量表达。本项目研究结果为腭发育及唇腭裂发病机理理论积累资料，最终为预防唇腭裂的发生提供理论依据。