水稻重金属转运基因OsNRAMP5功能位点的鉴定与机理研究

Cadmium (Cd) accumulation seriously affects the safety of rice food consumption. OsNRAMP5, which encodes a natural resistance-associated macrophage protein, is a major transporter of Cd and responsible for the transport of Cd from the external solution to root cells. The concentration of Cd in roots, shoots, and xylem sap of OsNRAMP5-loss-function plants was significantly reduced compared with WT plants. The existing OsNRAMP5 mutants are induced by ion beam mutation, which would reduce the accumulation of Cd, and also affect the absorption of other trace elements, resulting in the loss of rice yield and quality. Meanwhile, the molecular mechanism of OsNRAMP5 has not been identified yet. In this study, we plan to construct CRISPR/Cas9-induced target mutated lines of OsNRAMP5 at all exons, and to explore the function difference of exons on the absorbing Cd and trace elements. Further, the key transferring site of trace elements of OsNRAMP5 was selected using random mutant library and yeast metal transfer mutants, and identification its function in rice plant by CRISPR/Cas9 technology. This study will help to reveal the molecular mechanism of selective transporting different metal ions in OsNRAMP5, and establish theoretical foundation for developing a new variety of low cadmium accumulation rice.

镉积累严重影响稻米食用安全。已知水稻镉积累过程中，天然抗性巨噬细胞蛋白基因OsNRAMP5控制根部Cd2+的转运吸收起到决定作用。OsNRAMP5功能缺失可有效降低镉积累。现有OsNRAMP5突变体均由离子束诱变产生，在降低镉积累同时，也影响其他微量元素的吸收，降低水稻产量和品质，且该基因转运金属离子的分子机制不清楚。本项目拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在OsNRAMP5基因各外显子上分别创制功能缺失突变体，通过比较这些突变体中镉、锰等积累状况，解析OsNRAMP5不同序列片段对金属元素转运能力和农艺性状的影响；同时，利用OsNRAMP5随机突变文库和酵母金属转运突变体，筛选OsNRAMP5金属离子选择性转运的关键功能位点，并通过靶向基因编辑技术在水稻体内验证其功能。本研究有助于揭示OsNRAMP5选择性转运不同金属离子的分子机制，并为分子设计和培育低镉积累水稻新品种奠定基础。

镉污染严重影响稻米食用安全。已有研究表明，天然抗性巨噬细胞蛋白基因OsNRAMP5在水稻根部调控镉的吸收、转运过程中起关键作用，OsNRAMP5功能缺失后可有效降低水稻中镉积累，但作用机理尚不明确。本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，针对OsNRAMP5基因各外显子进行靶向编辑，创制功能缺失突变体，最终获得了13株不同突变形式的纯合突变单株，突变多为1-8个碱基的插入或缺失，推测此种非3整倍数的碱基缺失或插入，造成编码发生移位错误，从而导致OsNRAMP5基因功能缺失。高镉胁迫下，osnramp5突变体籽粒形态、千粒重等主要农艺性状与野生型无显著差异。通过检测突变体根、叶和籽粒的镉、锰含量发现，大部分Cd2+含量显著低于野生型。其中第5 外显子靶向突变后，叶、籽粒中镉积累水平较其他突变体更低，推测其可能是OsNRAMP5基因调控镉的一个关键位点。同时，利用Error-prone PCR技术构建OsNRAMP5基因突变文库，在双突变酵母中筛选金属转运突变体；经测序比对发现，突变不在OsNRAMP5功能位点，未造成OsNRAMP5功能失活，因此目前尚未能筛选到目标突变体。本研究利用基因编辑技术创制了水稻OsNRAMP5基因功能缺失的纯合突变体，找出了控制该基因参与调控重金属镉且不影响水稻生长的关键片段/位点，推测碱基的移码突变可能是造成其功能缺失的主要原因，初步阐明了OsNRAMP5基因选择性转运金属离子的分子机理，为低镉水稻品种改良和培育奠定了材料和理论基础。