羟基喜树碱诱导成纤维细胞内质网应激性凋亡预防关节粘连的机制研究

Intraarticular adhesion is a common problem after knee surgery. Our study found that hydroxycamptothecin (HCPT) have a significant effect on inducing fibroblast apoptosis and can prevent scar tissue adhesions effectively. HCPT mainly induce apoptosis through activation of caspase, but there are other means that HCPT-induced apoptosis in fibroblasts are not yet clear. This study is to investigate the mechanism of HCPT-induced fibroblast apoptosis from the endoplasmic reticulum stress pathway. The rabbit intraarticular adhesion model of rabbits are used and expression levels of the key elements of endoplasmic reticulum stress (CHOP, Caspase-12 and JNK, etc.)are detected to certify HCPT induce fibroblasts apoptosis through endoplasmic reticulum stress passway. Meanwhile, RNA interference suppression of CHOP and caspase-12 expression are used to explore its in vivo and in vitro apoptosis levels of cultured fibroblasts, and clarify exact molecular mechanisms of HCPT-inducing fibroblasts by the endoplasmic reticulum stress signaling pathway.The study want to investigate the molecular mechanism of prevention of postoperative adhesions by HCPT after knee surgery, and provide new methods to prevent intra-articular adhesions after knee surgery.

膝关节术后出现的关节内瘢痕粘连，是关节外科中常见的问题。本课题组研究发现羟基喜树碱（HCPT）在预防组织瘢痕粘连方面有显著疗效，并初步证实其能诱导成纤维细胞凋亡，减少膝关节术后粘连。羟基喜树碱主要通过激活内源性和外源性caspase途径诱导细胞凋亡，但HCPT是否还通过其他途径诱导成纤维细胞凋亡目前尚未清楚。本研究拟从内质网应激途径探讨HCPT诱导成纤维细胞凋亡的机制。通过制备兔膝关节术后关节内粘连模型，检测内质网应激关键分子（CHOP、Caspase-12和JNK等）表达水平的变化，观察HCPT是否通过内质网应激途径诱导成纤维细胞凋亡，并利用RNA干扰技术抑制CHOP和caspase-12的表达，探讨其对体内和体外培养的成纤维细胞凋亡的分子学机制，阐明HCPT从内质网应激途径诱导成纤维细胞凋亡的确切信号通路，探讨HCPT预防膝关节术后粘连的分子机制，为预防膝关节术后的关节粘连提供新思路。

研究的背景和目的：成纤维细胞的过度增殖是膝关节瘢痕粘连的主要原因，而HCPT能抑制成纤维细胞的增殖预防膝关节瘢痕粘连。本研究拟探讨HCPT对人瘢痕成纤维细胞的影响。内质网应激途径在HCPT诱导人瘢痕成纤维细胞凋亡中的作用及机制研究。.实验方法：CCK-8检测不同干预对成纤维细胞活性的影响。流式细胞分析技术检测细胞凋亡率。Hoechst33342染色法检测细胞凋亡。Western blot法检测Cleaved Caspase-3 、Cleaved PRAP的水平变化及活化情况。Western blot法检测P-PERK、PERK、P-eIF2α、eIF2α、ATF6、P-IRE1 、IRE1、GRP78、CHOP、Bax、Bcl-2的表达及活化情况。慢病毒转染沉默相关基因证明内质网应激相关蛋白与HCPT诱导成纤维细胞凋亡的相关性。制备膝关节粘连模型，局部应用不同浓度的HCPT，观察其预防膝关节粘连的效果和瘢痕组织中内质网应激相关蛋白及GRP78和CHOP的表达情况。.实验结果：HCPT能降低成纤维细胞细胞的活性，并且呈浓度和时间依赖性。Hoechst33342染色和流式细胞结果示HCPT显著提高人成纤维细胞的凋亡率。HCPT显著增加成纤维细胞内质网应激相关蛋白活化及表达量，且呈浓度和时间依赖性。转染PERK shRNA、ATF6 shRNA、IRE1α shRNA减少Bax/Bcl2比率、GRP78、CHOP蛋白表达，显著降低HCPT诱导的成纤维细胞凋亡。动物实验结果显示HCPT能有效预防兔膝关节瘢痕粘连，1mg/ml为最适浓度。同时HCPT处理组的瘢痕中GRP78、CHOP的表达量明显高于对照组，内质网应激相关蛋白p-PERK、p-IRE1α及ATF6-p90表达量也呈浓度依赖性。.结论：HCPT显著增加成纤维细胞内凋亡相关蛋白PARP及Bax/Bcl2的表达，从而导致凋亡。内质网应激中的PERK、IRE1α及ATF6三条通路在HCPT诱导的成纤维细胞凋亡中起关键性作用，HCPT能通过内质网应激诱导成纤维细胞凋亡，预防兔膝关节瘢痕粘连。