藏药吉尔巴调控DR血管内皮功能稳态及其信号转导机制研究

糖尿病视网膜病变（DR）是主要的致盲性眼病之一，是视网膜血管内皮功能长期损伤的结果，早期防治尤为关键。.糖尿病（京尼萨库病）是藏医的特色优势病种，本项目基于前期自然基金研究基础，针对DR血管内皮细胞损伤的关键环节，提出"整体多点调控'PKC-HIF-VEGF'信号通路是藏药吉尔巴重构DR血管内皮功能稳态的重要机制"假说，应用缺氧高糖VEC损伤模型、自发性糖尿病GK大鼠DR模型，采用HPLC-DAD/FLD指纹图谱等现代分析手段，结合血清药物化学方法，运用电镜分析细胞形态学，45Ca检测跨膜内流，RT-PCR、Western bloting等技术检测PCK-β、HIF-1α、VEGF等相关细胞因子，通过主成分分析（PCA）等统计方法分析药效与化学信息相关性，多学科交叉，探索藏药吉尔巴重构DR血管内皮功能稳态的作用机制，发挥藏医药防治糖尿病及其并发症的特色优势，进一步指导糖尿病藏医临床用药。

糖尿病视网膜病变（DR）是主要的致盲性眼病之一，是视网膜血管内皮功能长期损伤的结果。高血糖状态下，视网膜血管内皮细胞PKC-β途径活化伴随着DR发生及发展的始终，诱导HIF-1α/VEGF低氧信号通路偶联表达呈正相关性增强。本项目针对DR血管内皮细胞损伤的关键环节，提出"整体多点调控'PKC-HIF-VEGF'信号通路是藏药吉尔巴重构DR血管内皮功能稳态的重要机制"，优化煎煮工艺，HPLC法测定有效成分，复制三种不同发病机制的DR动物模型，ig给药，微量血糖仪测定血糖水平，免疫组化、RT-PCR、Western blotting等技术检测PKC-β、HIF-1α、VEGF等因子表达。结果表明：①小檗碱等三种异喹啉类生物碱为主要有效成分。②对四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型，吉尔巴有明显降糖作用（P＜0.01），对正常小鼠血糖无明显作用。③对链脲霉素致大鼠DR模型，吉尔巴有明显降糖作用（P＜0.01）；明显降低血清MDA含量、升高SOD活力（P＜0.01），减轻氧化应激反应的损害作用；明显降低血清中ICAM-1和ANGⅡ含量（P＜0.01）；视网膜三种因子基因表达明显降低（P＜0.05）；视网膜HIF-1α、VEGF的蛋白表达明显降低（P＜0.05），高剂量组视网膜PKC-β的蛋白表达明显降低（P＜0.05），减轻视网膜血管损伤。④对自发性db/db小鼠DR模型，吉尔巴有明显降糖作用（P＜0.05）；视网膜三种因子基因表达有降低趋势；高、低剂量组PKC-β蛋白表达明显降低（P＜0.01），中剂量组PKC-β蛋白表达有降低趋势；高、中剂量组HIF-1α蛋白表达明显降低（P＜0.01），低剂量组HIF-1α蛋白表达量有降低趋势；VEGF蛋白表达明显降低（P＜0.01）。同时，高糖培养视网膜血管内皮细胞损伤模型的结果发现吉尔巴对视网膜内皮细胞的损伤改善不明显，“肠道黏膜系统PKC信号通路级联放大效应可能是藏医口服治疗糖尿病视网膜病变的作用机制”。本项目从从整体、细胞和分子三个层次，对视网膜PKC-β、HIF-1α、VEGF表达进行了定性、定量、定位分析，探索了吉尔巴及其有效组分（小檗碱）口服对DR视网膜微血管损害的关键通路（PKC-HIF-VEGF ）的多点调控机制，提供了吉尔巴口服防治DR的实验证据，有利于指导藏医临床用药。