候选肝癌抑癌基因ZFHX3、ZNF395、FLJ20021的克隆及其在早期诊断应用中的初步研究

目前在分子遗传学水平上对肝癌的发生、发展与转移机制了解甚少，也没有较好的方法进行癌前期病变基因型的早期诊断，更谈不上基因治疗提高患者的生存率。我们的研究已证实：肝癌发生机制的重要环节是染色体不稳定性，而不是微卫星不稳定性；在4q、8p、16q上存在抑癌基因。进一步的实验表明，在染色体4q23、8p21.1、16q22.3位点上分别存在ZFHX3、ZNF395和FLJ20021候选抑癌基因。在此基础上，我们构建了这些候选基因的表达质粒，并将其转染至相应肝癌细胞株中，发现这些候选基因的表达可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖。此现象提示他们有可能是潜在的肝癌抑制相关基因。基于上述工作基础，我们将进一步测试和验证所克隆靶基因是抑癌基因及其与肿瘤的发生、发展、转移的相关关系，并用已克隆的抑癌基因进行癌前期病变的基因型的早期诊断，同时探讨肿瘤基因治疗的肝癌模型，以期为肝癌早期诊断和治疗提供必要的理论基础。

肝细胞癌是亚太地区最常见的肿瘤之一。目前在分子遗传学水平上对肝癌的发生、发展与转移机制了解甚少，也没有较好的方法进行癌前期病变基因型的早期诊断，更谈不上基因治疗提高患者的生存率。因此，寻找肝癌相关候选基因是目前肝癌研究领域里的重要研究热点。我们课题组应用分子生物学方法从BEL7402细胞株中发现126个碱基发生了变异，HepG2中133个，Hep3B 中316个。三种细胞株中T>C/A>G 和 C>T/G>A 碱基替代概率没有差异，其中18个基因发生碱基的缺失和插入，经分析还发现其中的11个基因(DDB2、NANA、 SF3B、 COX6C、 GNAS、 IL6ST、 MEN1、NANA、RPN1、 SF3B1和SFPQ)在其他肿瘤中也有表达；课题组经检测筛选并确定了44个肝癌肿瘤相关候选基因，其中突变的基因28个，融合基因16个。从44个基因中选取的6个基因（FN1、ZFHX3、LUZP1、ZNF395、LIN1、FLJ20021）在肝癌组织、癌旁组织及正常组织中通过mRNA表达水平检测分析，4个基因（FN1、ZFHX3、ZNF395、LIN1）在肝癌中均呈现低表达或表达缺失，证实这4个基因为肝癌候选抑癌基因。而FLJ20021和LUZP1基因在各组织中的表达差异不显著；通过对各种临床及病理指标与LIN1、ZNF395、ZFHX3和FN1基因表达水平间的相互关系研究，发现FN1基因的表达量与其生存期无明显差异，其表达量与肿瘤浸润门静脉相关，其表达量越低，肿瘤浸润门静脉的几率越高。而ZFHX3基因的表达与临床各项指标相关性不大。通过对LIN 1启动子CpG位点的甲基化水平（7和18位点）分析发现大多数肝癌（87.3%）呈低甲基化水平，LINE-1启动子低甲基化患者的平均术后无病生存率（DFS）比 LINE-1基因启动子高甲基化患者的水平低、总生存期（OS）也短。且CpG位点7和18位点的低甲基化与肿瘤大小、复发率、分期、分化程度都相关；在此基础上，我们构建了ZNF395候选基因的表达质粒，并将其转染至相应肝癌细胞株中，发现该候选基因的表达可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖，此现象提示该基因有可能是潜在的肝癌抑制相关基因。这些基因的发现将对肝癌的发生、发展、转移的研究具有重要意义。