荧光共振能量转移法研究CD44蛋白与其抗体的相互作用

细胞粘附分子（CD44）是一种细胞表面跨膜糖蛋白，它与肿瘤细胞的粘附、转移和入侵都有密切的关系。本项目拟合成包含荧光传能对的明胶纳米微球，并在其表面进行化学修饰，使其能够对CD44及其抗体分别进行荧光标记。当所标记的抗体与CD44发生特异性结合后，微球探针中包含的荧光传能对因为彼此距离的接近，发生荧光能量共振转移（FRET），对荧光供体分子的激发能够诱发受体分子发出荧光，同时供体分子的荧光强度发生衰减，荧光供体因能量转移，荧光发射被受体粹灭，荧光寿命缩短。通过计算FRET效率，获得标记的荧光探针在CD44抗体与CD44结合后的空间距离信息，由此可以对CD44与其抗体结合的反应动力学，以及反应前后CD44和抗体的构象变化进行研究，并结合分子模型理论计算，了解CD44与其抗体相互作用的机理，为CD44表达肿瘤的治疗，明胶包裹抗癌药物的靶向释放等方面的应用提供理论依据。

本项目采用共凝聚法制备了包裹水溶性荧光染料罗丹明B的明胶纳米微球，并在外层包覆聚甲基丙烯酸保护层。制得的纳米微球粒径约为60纳米。包裹后的罗丹明B荧光性能未发生改变，并且荧光发射强度与浓度在三个数量级成线性相关，可以作为荧光探针应用于定量分析。动态释放实验证实聚甲基丙烯酸保护层能有效延缓荧光染料的泄漏。制备的明胶纳米荧光微球具有良好的生物相容性，可用于细胞荧光成像。.还利用醋酸根修饰的明胶纳米微球的可逆温敏效应，对糖化酶进行了固定化。在室温时，明胶纳米微球处于致密状态，粒径为155纳米。当温度升高后，微球发生溶涨，粒径增大；温度下降后，又恢复至致密状态。在其处于溶涨状态时，与糖化酶溶液混合后，能够吸附糖化酶，随后将温度降低，可将酶固定。经离心分离，除去游离酶。将固定了糖化酶的明胶微球所处的温度再次升高时，溶涨的明胶微球可有效地将酶释放，最高释放率达99.3%。