稀有放线菌小单孢菌中接合转移相关基因和位点的克隆及其功能研究

小单孢菌是一类产生多种抗生素的稀有放线菌。小单孢菌40027菌株含有2个内源质粒- - pJTU101和pJTU112，其中，质粒pJTU112具有自主接合转移功能，本项目通过对小单孢菌内源质粒pJTU112全序列测定和生物信息学分析，预测小单孢菌中与接合转移相关的潜在基因和位点。进一步通过基因缺失和功能互补实验，确证小单孢菌中接合转移相关基因和位点；并利用不同拷贝数载体，研究小单孢菌中不同拷贝数接合转移相关基因和位点对接合转移的影响。再利用细菌双杂交、Pull-down等技术，筛选并验证小单孢菌中接合转移相关基因的互作基因。明确小单孢菌中接合转移相关基因和位点的生物学功能，阐明小单孢菌中接合转移的分子机理，建立小单孢菌接合转移系统。研究结果对小单孢菌中遗传信息水平转移分子机制的揭示具有重要的理论意义，对小单孢菌遗传育种和较大DNA片段的遗传转移具有重要的应用价值。

小单孢菌是一类产生多种抗生素的稀有放线菌。小单孢菌40027菌株含有2个内源质粒——pJTU101和pJTU112，其中，质粒pJTU112具有自主接合转移功能。对小单孢菌内源质粒pJTU112全序列测定和生物信息学分析，质粒pJTU112全长13,648bp，G+C含量为74.6%，包含13个ORF，其中pJTU112.3、pJTU112.4和pJTU112.5与质粒复制功能相关，pJTU112.1、pJTU112.2、pJTU112.12和pJTU112.13与质粒接合转移功能相关，pJTU112.6与质粒pJTU112的位点特异性重组相关，pJTU112.9与质粒的抗生素抗性相关。将质粒pJTU112的不同片段导入消除质粒的小单孢菌40027菌株，质粒pJTU112的复制区定位在约4.7kb的SacI-KpnI片段上。利用pHZ199构建了质粒pJTU112的衍生质粒pSCU213、pSCU214和 pSCU215等，通过大肠杆菌与小单孢菌间的接合转移，将重组质粒转入小单孢菌LXH20菌株中，再通过小单孢菌间的接合转移，确定了质粒pJTU112接合转移功能区。对pJTU112.1、pJTU112.2和pJTU112.12编码的蛋白比对分析，发现pJTU112.1（302aa）与红球菌细胞分裂蛋白FtsK有32%同源性，pJTU112.2（478aa）与小单孢菌细胞分裂蛋白FtsK/SpolIIE具有69%的同源性，并且pJTU112.2中包含保守的FtsK/SpolIIE结构域，同时pJTU112.2中含有一个保守的氨基酸序列（RAAGI）和一个保守的核酸结合位点GAGKS，pJTU112.12（785aa）与链霉菌(S. avermitilis)MA-4680中主要的质粒转移蛋白有38%的同源性，含有Ftsk_gamma结构域。明确小单孢菌中接合转移相关基因和位点的生物学功能，阐明小单孢菌中接合转移的分子机理，建立小单孢菌接合转移系统。研究结果对小单孢菌中遗传信息水平转移分子机制的揭示具有重要的理论意义，对小单孢菌遗传育种和较大DNA片段的遗传转移具有重要的应用价值。