基于废纸脱墨性能要求的新型双功能嵌合酶的分子设计、作用机制及其应用基础

Enzymatic deinking is now being considered as a suitable alternate option for waste paper deinking due to some advantages.However, it is necessary to further improve its deinking efficiency, reduce cost and solve compatibility with deinking process for its industrial application. Enzymatic deinking is carried out in solid (waste paper)-liquid(enzyme) reaction system, efficiently enzymatic deinking therefore requires enzyme can specifically bind with substrate and specifically hydrolyze component as well. Single native enzyme may not meet all reqiurement,multiple enzymes combination could resulted in better performance,but still remained some limitation..In this project, we rationally construct novel bifunctional chimeric enzymes by end-to-end gene fusion strategy. These novel chimeric enzymes contain two catalytic domains and carbohydrate-binding module(CBM). The inner molecular synergism among individual module in chimeric enzyme may increase enzymatic deinking efficiency by enhancing the specific binding and catalysis properties of chimeric enzymes.This research may provide new strategy and theoretical basis for development of more efficient enzymes for deinking and other paper industry related areas.

酶法脱墨具有很多优势可望成为新的废纸脱墨技术，不过，要实现酶法脱墨在在废纸回收工业中大规模的应用，还需进一步提升酶法脱墨效率，降低酶的使用成本等一些关键性问题。在酶法脱墨固（废纸）-液（酶）的反应体系中，酶的脱墨效率和酶能否"有效结合"到需要作用的不溶性底物并通过"有效降解"需要降解的组分等能力有很大的关系，单一天然酶难以满足所有的要求，多酶复合使用具有更好效果但仍存在不足。. 本项研究旨在利用基因融合方法，基于酶法脱墨对酶的性能要求理性设计新型双功能嵌合酶，在同一个酶分子中同时具备二种催化活性及特定的底物结合能力，通过分子内多功能域的协同作用，改善"有效结合"和"有效降解"来进一步提升酶法脱墨效率。研究成果为高性能的生物脱墨酶制剂的开发寻求新的思路和理论基础，推动酶法生物脱墨技术在我国废纸回收工业中的工业化应用，也将对适合造纸工业其他方面需求的新型酶制剂的开发提供新的理论依据。

基于废纸脱墨对酶性能要求，设计并构建具有多种具体双功能活性的融合酶，研究融合酶及其相应单酶的酶学性能及其废纸脱墨机制，主要结果如下：.1、共完成5种融合酶的构建及表达，分别为来自Volvariella volvacea纤维素酶（EG1）/木聚糖酶（XynII）的融合酶（Xyn-EGICD）；来自于Melanocarpus albomyces纤维素酶（MaEG）/漆酶（MaLac）的融合酶（MaLac-(GS4)3-MaEG）；来自草菇纤维素酶（EG1）和Thermomyces lanuginosus 脂肪酶（Lip）的融合酶（Lip-EG1CD）；来自Thermomyces lanuginosus 脂肪酶（Lip）和Thielavia terrestris的角质酶（TtCut）的融合酶（Lip -TtCut）；来源于Bacillus licheniformis漆酶(BlLa)/纤维素酶(BlEG)的融合酶（BlLac-BlEG）。.2、系统研究融合酶和各自对应的单酶酶学性能，融合酶Xyn-EGICD，MaLac-(GS4)3-MaEG和BlLac-BlEG的比酶活和相应的单酶一致，而Lip-EG1CD和Lip-TtCut融合酶，其内切纤维素酶活和单酶相近，但其脂肪酶的比酶活为单酶Lip的4倍。但MaLac-(GS4)3-MaEG和BlLac-BlEG二种融合酶在蛋白表达过程的易被降解。.3、系统研究了Xyn-EGICD，Lip-EG1CD和Lip-TtCut三种融合酶对激光打印废纸和新闻纸的脱墨效果研究，融合酶在油墨去除率，纸浆白度，纸浆物理性能等方面均优于相应的单酶及其混合酶，证明融合酶在废纸脱墨中的巨大优势和应用前景。.4、系统地研究了碳水化合物结合域（CBM）对纤维素酶、乙酰木聚糖酯酶催化性能的影响。外加CBM能显著提高内切型纤维素酶（FmEG）对纤维素的活性和连续降解性能；将乙酰木聚糖酯酶（AXEI）中家族1的CBM替换为具有木聚糖结合能力的家族6和22-2的CBM能显著提高乙酰木聚糖酯酶（AXEI）的活性及和木聚糖酶的协同作用性能，本研究为纤维素酶的分子改造提供了一种新的思路。