基于纳米颗粒-细胞DNA适配子方法检测体外CTC预测肝癌微转移的研究

术后转移复发是导致肝细胞癌（HCC)预后不良的重要因素。肿瘤转移复发的过程是循环肿瘤细胞(CTC)定植生长的级联放大瀑布效应，筛选出特异结合转移肿瘤细胞表面分子探针检测CTC预测转移复发从而优化治疗方案，是HCC治疗预后好坏的关键。本项目将消减杂交原理引入SELEX筛选，以遗传背景相同但转移潜能有明显差异的两个肝癌细胞系MHCC97-L(低转移)和HCCLM3(高转移)分别为消减靶子和筛选靶子，筛选特异识别高转移潜能肝癌细胞HCCLM3而不识别低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L的单链DNA适配子。将筛选出特异结合高转移肝癌细胞的DNA适配子耦联纳米磁珠，建立"纳米颗粒-适配子"方法检测肝癌肺转移外周血CTC。该项研究将获取特异结合高转移力肝癌细胞分子探针，为肝癌微转移的临床诊断提供可行的依据，同时也为进一步寻找肝癌细胞表面转移相关分子和肝癌肺转移的机理探索以及适配子靶向性治疗奠定理论基础。

我们以遗传背景相同但转移潜能有明显差异的两个肝癌细胞系，MHCC97-L（低转移）HCCLM9（高转移），分别为消减靶子和筛选靶子，采用消减cell-SELEX技术，筛选出特异识别高转移潜能肝癌细胞而不识别低转移潜能肝癌细胞单链DNA适配子。经过9轮筛选，分离、克隆、测序并获得6条适配子。经流式细胞和免疫荧光法等鉴定，有其中2条适配子与高转移肝癌细胞高亲和力结合，分别命名为LY-1、LY-13。通过体外合成LY-1适配子，经流式细胞和免疫荧光法鉴定，发现该适配子能特异结合高转移肝癌细胞，与低转移肝癌细胞、HepG2、Huh7、乳腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞SW48、胃癌细胞、宫颈癌细胞HeLa、外周血白细胞WBC等均不结合。蛋白酶K消化细胞后经流式检测以及荧光法分析，LY-1适配子与高转移肝癌细胞结合位点在膜表面。量子点耦联LY-1适配子的功能化生物分子探针，可识别体外培养的高转移肝癌细胞以及肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏和肺脏组织切片中肝癌细胞。经临床验证发现，量子点耦联LY-1适配子的功能化生物分子探针可识别肝癌病人肝脏组织切片中高转移性肝癌细胞。FITC标记的适配子在流式细胞仪上可识别出外周血模拟环境中高转移肝癌细胞，基于LY-1适配子耦联磁颗粒的复合物可捕获外周血模拟环境中的循环肝癌细胞。