栽培烟草与花烟草杂交不亲和性变化及花粉管突破花柱阻碍机制的研究

Interspecific crossing incompatibility was one of the main hinder to introduce beneficial charactars of wild species into cultispecies. But there were still no progress on the cross-incompatibility mechanism exploring self-compatible species as a female parent. In the cross-combination Nicotiana tabacum cv. (gla.)S K326×N.alata，pollen tubes stopped growing at the base of styles(0.81±0.10cm nearby the ovaries) and failed to set seeds. But if pollinated 48-120h after anthesis, the otherwise incompatibility (at the base of pistils) could be broke through. Pollen tubes of N.alata grew into ovaries, viable seeds were obtained and developed into plants, which were preliminarily indentified as hybrids. Cell mophlogy, physiology and biochemistry, gene transcription and protein translation were compared among pistils cross-pollinated at different developmental stages. In hoping to explore the physical and molecular basis of cross-incompatibility changing with the pistil aging, and rich research data on mechanism of interspecific crossing incompatibility and methods of improving it.

种间杂交不亲和往往阻碍优质野生种质资源在育种中的应用，但以自交亲和作物为母本的杂交不亲和机制始终未获得深入研究。以自交亲和的栽培烟草Nicotiana tabacum cv. (gla.)S K326为母本与野生种花烟草（N.alata）杂交时通常表现为不亲和，花粉管受阻于花柱特定部位（子房往上0.81±0.10cm处），无法获得杂种。项目组4年多地重复实验发现，当母本花开始进入衰老阶段（始开期后48-120h）再进行授粉（也即延迟授粉），花粉管却可以突破花柱基部阻碍，继续生长进入子房受精，并获得经初步鉴定为杂种的种子和植株。本项目拟以此杂交组合为材料，从雌蕊细胞、组织形态、生理生化、基因转录和蛋白表达等层面开展研究，探索伴随栽培烟草花朵衰老进程，延迟授粉突破花柱杂交不亲和的形态、生理和分子基础，探究该组合杂交亲和性发生改变的机制，丰富种间杂交不亲和机制及克服杂交不亲和性方法的研究资料。

针对栽培烟草和野生烟草种花烟草杂交授粉，花烟草花粉管在栽培烟草花柱基部生长受阻碍，而在雌蕊衰老后授粉，即“延迟授粉”克服了花柱基部不亲和阻碍，花粉管生长穿过花柱基部，并获得杂交后代。本项目研究了“延迟授粉”克服该组合杂交不亲和阻碍的调控机制，主要从雌蕊传导组织形态学、雌蕊生理学、基因和蛋白等方面开展研究。形态学研究表明，雌蕊衰老后，花柱基部传导组织细胞形态发生显著改变，包括细胞椭圆形化，胞间隙变大，胞间隙物质增多，这些形态学变化有利于花粉管穿过花柱基部，是衰老期亲和性提高的重要形态学基础；生理学研究结果表明：伴随雌蕊衰老，抑制花粉管生长的物质，如γ-氨基丁酸、甲硫氨酸含量降低；而促进花粉管生长的物质如脱落酸、吲哚乙酸含量增加，这可能为衰老期花粉管生长穿过花柱基部提供了有利条件；基因和蛋白研究结果表明：多个植物细胞壁蛋白在雌蕊衰老过程中上调表达，如纤维素酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶和β-果糖呋喃糖苷酶等，这些蛋白的高表达可能从传导组织细胞形态改变和营养物质供给两方面，促进衰老期花粉管生长；遗传验证表明，细胞壁蛋白DUF642过表达突变体始开期花柱不亲和阻碍在部分雌蕊中解除，表明该基因参与了花粉管生长和亲和性调控，该基因可能通过促进植物细胞壁果胶的降解，从细胞形态学角度参与亲和性调控；甲硫氨酸合成基因MET敲除突变体亲和性没有显著变化。综合形态学、生理学、基因和蛋白研究结果推测，延迟授粉克服该组合花柱基部不亲和阻碍受雌蕊传导组织形态学和生理学多重调控，可能不是受单基因遗传调控。该研究为延迟授粉提高种间杂交亲和性的科学寓意提供了参考。另外，为高效开展植物蛋白功能和烟草生殖繁育相关生物学问题研究，本项目构建了针对烟草雌雄蕊生殖器官的单克隆抗体库，包含15000个单克隆抗体及其抗体芯片，该抗体库为开展烟草及其近缘物种蛋白功能研究提供了丰富的单克隆抗体，将促进植物蛋白功能研究进展。