间充质干细胞来源的外泌体介导miR-214对大鼠随意皮瓣成活的影响及机制

The distal end of random skin flap is prone to ischemia necrosis. However, its viable therapeutic drugs are quite scarce in clinic. In our study, we found that VEGF promotes the formation of new blood vessels, which is of great significance for the survival of random flaps.However, its half-life is short and the utilization rate is low. It was found that exosomes secreted by mesenchymal stem cells could reduce the necrosis of random flaps in our pre-test. And recent study indicates that VEGF mediated by miR-214 from exosomes can promote angiogenesis. Therefore, we hypothesized that exosomes secreted by mesenchymal stem cells could improve the survival of random flap, and the mechanism is that VEGF mediated by miR-214 from exosomes can promote angiogenesis. Our team will: 1)define the effect of exosomes secreted by mesenchymal stem cells on the survival of random flaps in rats.2)explore the mechanism that exosomes secreted by mesenchymal stem cells could improve the survival of random flap by promoting angiogenesis in vitro. 3)study exosomes secreted by mesenchymal stem cells promote survival of the flap through the pathway of the VEGF mediated by miR-214 in human cell model.The aim of the study is study he protective effect of exosomes secreted by mesenchymal stem cells on the random flaps and its mechanism.Explore the intrinsic mechanism of random flap survival from gene level using miR-214 as the starting point,and thus provide a theoretical basis for the treatment of exosomes on flap survival.

随意皮瓣易发生缺血坏死，但可行的治疗药物并不多。本课题组前期研究发现VEGF促进新生血管的形成对于随意皮瓣存活具有重要意义，然而其半衰期短且利用率低。预实验发现间充质干细胞来源的外泌体能减少随意皮瓣的坏死，而相关研究表明外泌体所含miR-214可介导VEGF促进血管新生。因此，我们假设间充质干细胞来源的外泌体可通过miR-214介导VEGF促进血管新生，从而提高随意皮瓣成活。本课题组将：1）以大鼠随意皮瓣模型明确间充质干细胞来源的外泌体对随意皮瓣存活的作用；2）体外实验研究间充质干细胞来源的外泌体通过促进血管新生提高皮瓣存活；3）人体细胞模型研究间充质干细胞来源的外泌体通过miR-214介导VEGF促进皮瓣存活。本项目旨在研究间充质干细胞来源的外泌体对随意皮瓣的保护作用及其机制，以miR-214为切入点，从基因层面探索随意皮瓣成活的内在机制，从而为外泌体临床治疗随意皮瓣成活提供理论依据。

随意皮瓣在临床应用广泛，但是远端容易出现坏死。本课题研究探讨骨髓间充质干细胞来源的外泌体对大鼠随意皮瓣成活的影响及可能机制。成功提取SD大鼠的骨髓间充质干细胞，鉴定及诱导分化实验。提取外泌体，透射电镜下，其是具有完整的双层外膜包绕的囊泡。使用NTA技术检测其大小峰值在80-100nm左右。蛋白检测结果表明CD9、CD63及TSG101表达呈阳性，Calnexin蛋白为呈阴性表达。应用于大鼠随意皮瓣模型后，外泌体组的生存面积明显高于对照组及去外泌体上清液组。激光多普勒和氧化铅造影均显示外泌体组的血流信号强度明显高于其他两组。HE切片显示，在外泌体组可以看到大量的新生血管。免疫组织和WB结果，外泌体组在VEGF和CD34的表达上多于其他两组。外泌体组的SOD表达量明显高于对照组和去外泌体上清液组，MDA的表达则明显少于其他两组。WB及免疫荧光均显示外泌体组的 Beclin1、 LC3II的表达高于其他两组，表明自噬被激活。细胞实验显示，氧糖剥夺模型下培养，血管内皮细胞的活力显著下降；给予外泌体干预后，细胞活力有力显著的提高，细胞活力随着外泌体浓度正相关，200μg/ml时达到最高。划痕实验及成血管实验结果显示，外泌体则有助于提高细胞在缺氧环境下的成管能力。WB及qRT-PCR显示VEGF以及HIF-1α蛋白的表达及基因转录，在缺氧环境下会下降，给予外泌体干预后，相比于对照组及去外泌体上清液组，两种蛋白的表达升高。 在缺氧环境下，外泌体的正性保护作用，被PI3K抑制剂LY所抑制，成血管相关蛋白VEGF以及HIF-1α的表达下降。外泌体干预后，内皮细胞的PI3K，Akt，mTOR以及p70S6K的磷酸化水平则均处于升高状态；给予LY后，各蛋白的表达以及信号通路上蛋白的磷酸化水平均处于下降状态。使用miRNA-214-mimics 转染技术增强间充质干细胞中 miR-214的表达量后，通过相关检测，证实miR-214在其中发挥重要作用。. 本课题组探索和分析间充质干细胞来源的 Exosomes 治疗大鼠随意皮瓣成活中的关键 miRNA 以及相关基因的表达差异， 从基因表达层面探索随意皮瓣成活发生发展的内在机制。 从而为 Exosomes 在骨科领域的应用开辟新途径， 也为临床治疗随意皮瓣成活提供理论依据。