DNA甲基化在颞下颌关节骨关节炎发病机制中作用的研究

Temporomandibular joint osteoarthritis (TMJ-OA) is a common clinical disease in the oral and maxillofacial area. Since its pathogenesis is unclear, the treatment effect is not ideal. Our previous studies showed that TMJ-OA is a complex disease which multiple genes could be involved in. With its study in the pathogenesis and treatment of some human diseases, epigenetics has drawn more and more attention in recent years. DNA methylation is one of the most important epigenetic modifications. Aberrant methylation patterns are involved in important pathologies such as tumorigenesis and some complex diseases. The relationship between epigenetic regulation and OA is a new sight in OA pathogenesis research. In the present study, a genome-wide DNA methylation modification pattern between OA and normal cartilages will be detected by methylated DNA immunoprecipitation sequencing based on our previous TMJ-OA animal models, and the data will be further analyzed; combined with our previous Genechip results about differential gene expression pattern, the significant DNA methylation sites will be selected for further observing the change of its gene expression and analyzing of the relationship between DNA methylation and gene expression; primary condylar chondrocyte and chondrocyte cell line are further studied about the methylation of specific gene loci for preliminary gene regulation. Based on the above study, the role of DNA methylation in TMJ-OA pathogenesis will be evaluated and a new research strategy would be supplied for the treatment of OA.

颞下颌关节骨关节炎 (temporomandibular joint osteoarthritis, TMJ-OA)是临床常见病，其发病机制尚不完全明确，治疗效果亦不理想。本课题组以往研究表明TMJ-OA是一有多基因参与的复杂性疾病。随着表观遗传学在人类疾病发病机制和治疗方面研究越来越引起重视，表观遗传调节与OA关系的研究成为近几年OA发病机制研究中的一个新视点。DNA甲基化是最重要的表观调节机制之一。本研究拟通过已构建的TMJ-OA动物模型，比较OA与正常髁突软骨全基因组水平DNA甲基化修饰模式的差异；选择与OA发病相关、甲基化变异明显的基因，观察其基因的表达变化，分析DNA甲基化与基因表达变化之间的关系；采用原代髁突软骨细胞和软骨细胞系进一步对特定基因的甲基化位点进行初步的调控研究。通过以上研究评价DNA甲基化在TMJ-OA发病机制中的作用，以期为该病治疗提出新的治疗策略和实验依据。

本研究采用雄性Wistar大鼠(220-220g),36 只用于不同时间点颞下颌关节骨关节炎模型的病理学检查与分期,72 只用于髁突软骨基因组DNA 甲基化水平检测的大鼠,随机分为4 周、8 周和16 周三个时间组,每组24 只,随机选取12 只构建颞下颌关节骨关节炎模型,另12 只作为正常对照;利用DNA 甲基化芯片技术检测不同时期正常与病变髁突软骨细胞的基因组DNA 甲基化水平;通过生物信息学分析,对DNA 甲基化变化明显的基因做进一步分析和筛选;同时整合本课题组以前基因表达谱芯片的研究结果,挑选出可能与骨关节炎发病相关、且受DNA 甲基化调控的关键基因;另240 只大鼠随机分为4 周和16 周两个时间组,每组包括DNA 甲基化验证组和mRNA 验证组,通过Real-time PCR 和MeDIP-qPCR进一步验证其DNA 甲基化改变与基因表达变化之间的关系。病理学染色表明术后4 周、8 周和16 周髁突改变情况符合骨关节炎早期、中期和晚期的病理变化,显示颞下颌关节骨关节炎动物模型构建成功。通过DNA 甲基化芯片检测共发现9489 个差异的DNA 甲基化区间,440 个基因在颞下颌关节骨关节炎不同阶段DNA 甲基化呈持续性变化,其中大部分基因(约80%)的DNA 甲基化水平显著降低,且多为细胞周期调控过程相关的基因。不同年龄段对照组大鼠髁突软骨细胞的DNA 甲基化水平基本保持相似(R 早期=0.84,R 中期=0.82,R 晚期=0.83),而早期、中期和晚期颞下颌关节骨关节炎大鼠的DNA 甲基化水平与相应的对照组相比,则发生了明显变化(R 早期=0.68,R 中期=0.67,R 晚期=0.47),并发现一批未被报道过的差异DNA 甲基化基因,如紧密连接蛋白家族(Claudin)、Gadd45 家族,以及TGFβ、MAPK 信号通路等。所筛选的关键基因如Adamts5、Cldn11、Chad 和Tnf的DNA 甲基化水平被进一步证实与其mRNA 表达之间存在负相关关系。本研究采用的大鼠颞下颌关节骨关节炎动物模型能较好地模拟骨关节炎的病理学变化过程;在大鼠颞下颌关节骨关节炎的不同阶段,髁突软骨细胞的DNA 甲基化水平存在着动态变化,提示DNA 甲基化水平的变化可能是与骨关节炎密切相关基因异常表达的重要原因之一。