基于微孔阵列芯片构建3D人血脑屏障模型研究中药配伍的中枢减毒机制

A 3D human blood-brain barrier (BBB) model using microwell arrays will be built, to study the central toxic attenuation by compatibility of Traditional Chinese Medicine. Working with collaborators from the National University of Singapore, we have successfully fabricated hydrogel microwell arrays by a photolithography to establish various in vitro 3D cell culture models. In this proposal, an in vitro 3D human BBB model will be developed, and the effects of culture conditions on the BBB tight junction and the regulation of drug transporters will be investigated. Combining with the transporter over-expressing cells and animals, Ephedra and Aconiti Lateralis Radix Praeparata will be used as the model with CNS toxicity to study the BBB transport mechanism of their toxic alkaloids. Furthermore, the effects on the BBB transport of these alkaloids by different compatibility will be investigated to explain the toxic attenuation mechanism. The present work will be of great help for the pharmacokinetic studies of the Traditional Chinese Medicine.

以方剂配伍减毒为切入点，构建3D人体血脑屏障（BBB）模型，研究配伍对中药毒性成分脑部转运的影响。课题组前期与新加坡国立大学合作，采用光刻微加工技术制造出水凝胶微孔阵列芯片，并成功培养了多种细胞的3D体外模型。本课题拟进一步构建可模拟体内微环境的3D人体BBB模型，探索不同培养因素对BBB紧密连接和转运蛋白调控的影响；结合转运蛋白过表达细胞和动物模型，以具有中枢毒性的中药麻黄和附子为研究示范，从分子、细胞、3D微组织以及生物体水平阐明有毒生物碱成分的BBB转运机制；运用该模型诠释配伍对这些生物碱成分脑部摄取的拮抗作用，揭示配伍减毒机理，丰富祖国医学治疗思想，拓展中药药代动力学研发思路。

血脑屏障（BBB）的复杂性制约了人们对中药毒性成分BBB转运及其引起的药物相互作用的认识。在两年期的项目执行期间，我们与新加坡国立大学深度合作，以方剂配伍减毒为切入点，从分子、细胞、3D微组织、生物体水平系统研究了中药毒性成分的BBB转运特性以及配伍对脑部转运的影响。具体成果包括以下四个方面：1）借助光刻硅片模板，翻模制备出PDMS印章，用印章成功制备了PEGDA水凝胶微孔阵列芯片，每张芯片上有15×15个微孔（直径200µm）；2）按照BBB的生理结构，将永生化人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3、人脑胶质瘤细胞U87与人脑原代周细胞HBVP按不同的密度和培养模式（单培养、二元共培养和三元共培养）导入水凝胶微孔，培养多细胞球样体，发现三元共培养是此新型体外BBB模型成功的关键；3）以具有中枢毒性的麻黄和附子为研究示范，选择麻黄生物碱（麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱）和附子双酯型生物碱（乌头碱、新乌头碱、次乌头碱）为模型药物，运用细胞摄取和小鼠原位脑灌流技术，首次发现吡拉明敏感的逆质子有机阳离子转运蛋白在所有模型生物碱的脑部吸收中发挥着重要作用；4）运用微孔3D BBB模型和MDR1-MDCKII细胞跨膜转运模型，发现麻黄汤中甘草的特征性成分可显著降低麻黄生物碱的脑部吸收；附子理中汤中甘草、干姜、党参、白术的特征性成分可促进附子生物碱的外排转运，证明转运蛋白介导的药物相互作用是复方配伍减毒的关键。本课题为高通量评价中药活性成分穿透血脑屏障能力构建了新的技术平台，拓展了中药药代动力学的研究思路。