“非病毒基因活化基质”转染ephrinB2促进牙髓血运重建术的实验研究

How to form vascular network rapidly in new regenerated tissue in root canals, and promote stem cells in canals differentiating into odontoblasts, determine the success of dental pulp revascularization. Our previous studies demonstrated that, dental stem cells transfected with ephrinB2 have enhanced osteogenic capacity, and promote new vascular networks formation using surrounded vascular endothelial cells. However, it is difficult to obtain dental stem cells and have the possibility of contamination to culture stem cells in vitro. Besides, the virus using in transfection is a potential risk for patients. Non-viral gene-activated matrices could be implanted in patients and transfect surrounded cells automatically. In this project, parameters will be optimized to improve transfection efficiency of polyethyleneimine in vitro. We will detect osteogenic and angiogenic capacity of stem cells after transfection, and the expression of related molecules. PEI-ehrinB2 GAM will be constructed using optimized PEI and collagen-nanohydroxyapatite. Finally, we will evaluate the effect of PEI-ehrinB2 GAM in dental pulp revascularization using periapical periodontitis model of beagle dogs.

如何使根管内新生组织快速地形成血管网，并促进根管内干细胞分化为成牙本质细胞，是决定牙髓血运重建术成败的关键。我们前期实验证实：体外转染ephrinB2的牙源性干细胞具备更强的成骨能力，并能促进周围的血管内皮细胞更快地形成血管网。但体外培养干细胞存在细胞来源困难和污染的可能性，且在转染过程中常用的病毒载体也对患者构成潜在的风险。“非病毒基因活化基质”（gene-activated matrices，GAM）可以被植入患者体内自动转染其周围的细胞。在本项目中，我们将通过体外实验来优化非病毒载体聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）的参数以提高其转染效率，检测转染后的干细胞成骨能力和促血管形成能力的变化，以及上下游相关因子分泌的情况。我们将优化的PEI与纳米羟基磷灰石胶原支架混合制成PEI-ephrinB2 GAM，最后使用比格犬根尖周炎模型来验证其在牙髓血运重建术中的效果。

牙髓血运重建术可以用于治疗年轻坏死的恒牙，促进牙髓功能再生，决定其成败的关键在于如何使根管内新生组织快速地形成血管网，并促进根管内干细胞分化为成牙本质细胞。我们前期的研究发现ephrinB2可以调控牙源性干细胞的成骨和成血管能力。基于此，本项目重点研究了如何更好地转染ephrinB2，以及转染了ephrinB2的牙源性干细胞在动物体内成血管和成骨能力有何变化及其机制。（1）我们研究发现，转染了ephrinB2的根尖牙乳头干细胞能够表达更多的血管内皮细胞生长因子，促进血管内皮细胞的迁移、增殖，可以在低氧环境下更快地形成血管网。我们发现转染ephrinB2后的小鼠的成血管能力显著增强，且新生血管的数量和直径都显著增加。（2）此外，我们还发现基因转染ephrinB2使牙周膜干细胞和牙髓干细胞的成骨分化能力显著增强，我们发现牙周膜干细胞、牙髓干细胞高表达ephrinB2后，成骨分化标记物RUNX2、BMP2、ALP、OCN的表达上调。为了进一步验证高表达ephrinB2的细胞促进组织再生的能力，我们构建了比格犬牙槽骨缺损模型，探讨缺损区转染ephrinB2后的牙周膜干细胞或牙髓干细胞的组织再生能力。结果显示，相比于野生型细胞，ephrinB2基因修饰的细胞更能促进牙槽骨再生。该实验不仅进一步揭示了ephrinB2在牙周膜干细胞、牙髓干细胞成骨分化中的重要作用，而且构建的ephrinB2基因修饰的牙周膜干细胞、牙髓干细胞有望成为理想的干细胞，用于牙体组织或牙周骨组织再生。（3）最后，我们还探索了炎症环境下牙周膜干细胞成骨分化能力的变化以及ephrinB2的作用机制。我们研究发现，在牙周膜干细胞成骨分化过程中添加内毒素模拟炎症环境，可以下调牙周膜干细胞中ephrinB2的表达，并抑制其成骨分化，我们证实这是受LPS/TLR4信号通路调控。通过上调ephrinB2的表达，可以提高炎症环境下牙周膜干细胞成骨能力，为治疗牙周炎和种植体周围炎导致的骨缺损提供了新的思路。