应用DNA条形码技术探究多变根毛霉的种系发生及种群分类特征

近年，多变根毛霉所致皮肤及皮下原发感染的病例日渐增多，且绝大多数病例仅来自中国，鲜有其他国家报告。目前多变根毛霉的分类主要依赖传统的表型方法并归在根毛霉属中，但我们在前期研究中发现多变根毛霉在种系发生上与毛霉属主要分离自环境的冻土毛霉有较近的进化亲缘关系，且形态学上差异较小，我们还发现冻土毛霉按传统分类保存菌株亦存在较多鉴定错误。由于近年刚刚兴起的真菌DNA条形码技术非常适合用于形态学相近菌种间的分类鉴定，本研究拟采用真菌DNA条形码技术和扩增片段长度多态性（AFLP）等分子技术,对70余株环境来源的冻土毛霉和临床及环境分离的多变根毛霉进行种间和种内的遗传多样性差异比较和分子流行病学研究，并结合菌落形态、温度耐受、同宗和异宗配合等表型分类方法对上述类群进行重新分类与命名，对毛霉属DNA条形码库的构建进行补充和完善，探索多变根毛霉致病的可能来源和传播途径，为该病的有效预防提供分子遗传学依据。

近年，不规则毛霉（旧称：多变根毛霉）所致原发皮肤毛霉病的报告日渐增多，且绝大多数病例来自中国。本课题组近3年围绕不规则毛霉及其近源菌种冻土毛霉的分子分类、分子流行病学及表型特征展开了系列研究。通过基于多基因位点的测序及种系发生分析，发现不规则毛霉虽然与冻土毛霉具有较近的亲缘关系，且形态上极其相似，但DNA条形码分析显示该菌种仍处于单独的进化分枝上。同时，我们还应用AFLP技术对不规则毛霉进行分子流行病学研究，结果发现其不同亚群菌株存在一定程度的地域局限性，从而较好地解释了该菌的感染主要集中于以中国为主的亚洲地区的主要原因，为该病的有效防控提供分子流行病学依据。我们还进行了不规则毛霉全基因组测序，并与白念珠菌和烟曲霉的全基因序列进行了比较分析。结果不规则毛霉的基因组约34Mb，明显大于白念珠菌和烟曲霉，COG分析发现12504个编码基因，为今后进行毒力基因功能研究与验证奠定良好基础。在此基础上，我们收集了68株冻土毛霉进行了种系发生和AFLP分析，两种方法表现出较好的一致性。研究发现，以往以表型鉴定为主要分类方法的冻土毛霉存在较多鉴定错误，冻土毛霉实际为包括4个变种的复合体，且4个变种在不同的分析方法中均各自成群，均应做为独立菌种存在，同时发现部分新种有待进一步分类命名。围绕不规则毛霉和冻土毛霉的表型研究，我们进行了温度耐受、配合试验和真菌体外药敏试验。结果显示，不规则毛霉在37℃时生长明显抑制，而冻土毛霉则在33℃时生长即受到明显抑制。一方面较好地解释了不规则毛霉感染以面部肢端为主，目前未见侵袭性感染的报告这一特殊临床现象，另一方面亦解释了做为近源菌种，冻土毛霉却罕有感染报告的可能原因。配合试验研究显示不规则毛霉可发生异宗配合，形成配子囊，这亦是首次发现不规则毛霉的有性期。冻土毛霉亦可发生种内异宗配合，但与不规则毛霉未发成种间异宗配合，进一步支持这两种菌的分子分类结果。围绕不规则毛霉我们还对收集到的菌株进行了体外药敏研究。结果显示，该菌对两性霉素B的敏感性较高，对泊沙康唑和伊曲康唑存在菌株差异性，而对其他包括特比萘芬、伏立康唑、Isavuconazole及棘白菌素类药物均表现为耐药。综上，我们围绕不规则毛霉与冻土毛霉的系列研究，较好地解释多个临床相关问题，为更好地认识不规则毛霉感染的流行病学及临床特点提供理论依据，亦为今后的分类学和毒力基因功能研究奠定坚实基础。