酸胁迫下乳酸乳球菌非编码小RNAs042的高转录机制研究

Previous investigation has proved the regulatory role of several small non-coding RNAs in the acid response and acid tolerance system of Lactococcus lactis. Among them, the transcriptional level of s042 under acid stress was significantly up-regulated. s042 can improve acid resistant capability of the strain by acting on arginine metabolism regulator ArgR and other target genes. However, the response mechanism of s042 to acid stress is still unclear. We applied bioinformatics software to predict the promoter region of s042 and the related transcriptional regulators. In this research, DNA affinity chromatography-pull down technique will be used to attain the proteins which can bind to s042 promoter under acid stress. EMSA experiment will be applied to screen and verify the upstream transcriptional regulators of s042 in vitro. The regulator overexpressing, deficient and complementary strains will be constructed. The binding ability between s042 promoter and the transcriptional regulators will be verified in vivo by Northern blot, reporter gene system and ChIP-qPCR technique. Finally, the binding sites of the transcriptional regulator and s042 promoter will be determined by molecular simulation, DNase I footprint assay and site mutation combined with EMSA experiment. Not only is this research essential for elucidating the response mechanism of L. lactis sRNAs under acid stress, but it lays foundation for further constructing the transcriptional regulator-sRNA synergistic regulation network.

前期工作表明，多个非编码小RNA在乳酸乳球菌酸响应及酸耐受体系中起重要的调控作用。其中s042在酸胁迫下转录量明显上调，且能通过作用于精氨酸代谢调控因子ArgR等提高菌株的耐酸能力。然而s042在酸胁迫下的高转录机制尚不清楚。我们采用生物信息学软件预测了s042的启动子区及可能与之结合的转录因子。本课题拟进一步利用DNA pull down技术调取酸应激过程中与s042启动子区结合的蛋白，经EMSA体外验证获得s042的上游转录因子。构建该转录因子过表达、缺失及回补菌株，利用Northern blot、报告基因系统以及ChIP-qPCR的方法进行体内验证。最后利用分子模拟、DNase I足迹以及点突变结合EMSA实验确定该转录因子与s042启动子区的结合位点。本课题不仅对阐明酸胁迫下乳酸乳球菌sRNA的响应机制具有重要意义，而且为进一步构建酸胁迫下转录因子-sRNA协同调控网络奠定基础。

前期工作表明，多个非编码小RNA在乳酸乳球菌酸响应及耐受体系中起重要的调控作用。其中s042在酸胁迫下转录量明显上调，且能通过作用于精氨酸代谢调控因子ArgR等提高菌株的耐酸能力。我们首先利用DNA pull down技术调取酸应激过程中与s042启动子区结合的蛋白，获得了WP_010906046.1、WP_017864420.1和WP_010905240.1三个候选调控因子。EMSA实验结果表明转录因子 WP_010906046.1 和 WP_017864420.1在体外与 s042 启动子无明显相互作用，而WP_010905240.1（TetR/AcrR家族转录调控因子） 在浓度 2uM 时便能够阻滞 s042启动子的电泳迁移率。我们采用DNase I足迹确定了WP_010905240.1在s042启动子的16bp的结合位点序列GAAAACTGATTTGGTA。随后我们构建了调控因子WP_010905240.1的过表达及缺失菌株，耐酸性实验证明该调控因子可显著降低菌株的耐酸能力。RT-qPCR 实验结果进一步表明，WP_010905240.1在酸性条件下显著下调，并能够抑制 s042的转录量。本课题首次发现乳酸乳球菌中存在TetR/AcrR家族成员可在酸性条件下通过调控非编码小RNA的转录，提高菌株的耐酸能力。该发现不仅对阐明酸胁迫下乳酸乳球菌sRNA的响应机制具有重要意义，而且为进一步构建酸胁迫下转录因子-sRNA协同调控网络奠定基础。另外，我们揭示了乳酸乳球菌中NisI的成熟过程，并确定了其对nisin耐受性的影响。结果表明，脂蛋白信号肽切割酶LspA主要影响NisI的免疫功能，而、脂蛋白二酰基甘油转移酶Lgt则负责NisI在细胞膜上的定位。该研究为提高乳酸乳球菌的nisin耐受及工业生产能力提供了新策略。我们还发现nisin与苯乳酸具有显著的联合抑菌活性，并展示了其作为食品防腐剂的巨大潜力。我们进一步构建了nisin和苯乳酸联产工程乳酸乳球菌，其发酵产物的抑菌能力较原始nisin生产菌株得到大幅提升。扫描电镜观察结果发现，与nisin相比，苯乳酸表现出不同的作用模式，能够作用于分裂期细胞，这也是nisin和苯乳酸具有联合抑菌效应的关键。该联产菌株的构建也为开发新型的天然食品防腐剂提供了新的思路。