广谱中和抗病毒抗体基因片段缺失的分子机制研究

The identification of broadly neutralizing antibodies (bnAbs) against HIV-1 virus offers an opportunity for new vaccine design. These bnAbs, which are found only in a limited number of infected patients, have extensive somatic hypermutation (SHM) and frequent insertions/deletions (indels). Recent study on bnAb lineages mapping led to a B-cell lineage HIV-1 vaccination strategy, whereby several immunogens are designed and administered in sequential steps to guide maturation of the anti-HIV-1 bnAbs. A current major obstacle in HIV-1 vaccine research is the ability to produce bnAbs with high levels of indels. Studies of indels generation in antibody genes had been lacking due to the lack of assays that could detect the rare indel events. We have developed a mouse passenger allele system that allows robust detection and quantification of indel events. We propose to use this system to study the mechanisms that generate indels in antibody genes. In particular, the research would focus on addressing whether DNA double strand breaks and/or other DNA repair pathways are involved in generating indels. We will investigate and dissect the roles of different non-homologous DNA end joining pathways in generating indels. The aim of the research is to find an important factor/pathway that causes indels and then subsequently test whether indel levels could be increased via genetic manipulation and/or inhibitory molecules. Elucidating the mechanisms that generate indels in antibody genes could shed light on how anti-HIV-1 bnAbs evolve and thus help in HIV vaccine design.

高效广谱中和抗体的发现为HIV或广谱流感疫苗的研制提供了新的希望，但产生该类抗体的分子机制尚不清楚。这类抗体基因序列往往都经历了异乎寻常的碱基突变和片段缺失插入。虽然基因片段的缺失或插入是抗体多样化中概率极低的过程，却往往是抗体转变为高效广谱中和抗体的关键。根据抗体进化规律设计不同阶段疫苗分子，是当前HIV疫苗设计的策略。抗体进化中的关键步骤也是疫苗设计的难点。本项目拟在前期的工作基础上，利用小鼠抗体无功能等位基因模型，深入阐明抗体基因片段缺失的分子机制。首先，本项目将着眼于双链DNA损伤应答机制，并剖析不同非同源DNA末端连接机制对抗体基因片段缺失的作用，最终解析这一关键步骤的分子机制。在这基础上，本项目还将尝试构建抗体基因片段高效率缺失插入的动物模型，验证其能否产生高亲和力抗体。本项目中对抗体进化的关键步骤的研究，将为疫苗设计提供理论基础和新思路，并可能为生产高亲和力抗体提供新工具。

广谱抗病毒中和抗体具有大量的突变和抗体基因片段缺失和插入。这些基因片段的缺失和插入是抗体亲和力成熟过程中的小概率事件，却是这些抗体具有广谱中和能力的关键。抗体基因片段缺失和插入部分来源于AID作用于抗体基因后，DNA损伤修复因子对抗体基因的修复过程。因此，解析参与抗体基因片段缺失和插入过程中各个DNA损伤修复因子的作用，对深入理解广谱中和抗体成熟过程具有根本性意义。.为探究抗体亲和力成熟过程中抗体基因片段缺失和插入产生的机制，在本项目的资助下，本项目团队：1）建立了全新的抗体基因片段缺失和插入检测系统。利用CRISPR/Cas9系统，通过删除抗体基因V区剪接位点，快速建立了抗体无功能等位基因小鼠模型。通过优化小鼠免疫和细胞纯化方法，并进一步提升数据分析通量，可以极为深入地观察抗体基因片段缺失和插入。2）发现抗体基因体细胞高频突变过程中，大多数的片段缺失和插入为1-bp片段。1-bp缺失和插入是抗体基因移码突变的主要原因。3）不同长度的抗体基因片段缺失和插入的来源机制不同。单碱基的插入和缺失主要有单链DNA损伤产生，而多碱基的插入和缺失主要由双链DNA损伤起始。4）剖析了多种DNA损伤修复基因对各种类型抗体基因片段缺失和插入的影响，解析了抗体多样化过程中DNA损伤修复通路全景图。.受本项目资助的上述研究成果已发表或正在投稿过程中。这些成果揭示了广谱中和抗体产生过程中DNA片段缺失和插入，以及长CDR3产生的机制，为广谱中和抗体的筛选和诱导提供了全新的指导依据。在本项目资助下，本项目组多次参与国内外学术交流，与国内外多个课题组展开合作，项目成员获得多项奖励和基金支持。