OsDCL3b基因调控稻穗生长发育的遗传机理研究

Transgenic mutant rice plants with down-regulated expression of OsDCL3b and abnormal development and growth of panicles, ncRNAs(non-coding RNAs) expressing differentially in young panicles of the transgenic mutant and control, and transgenic T0 plants with over-expressing of OsDCL3b have been obtained in our previous research. In this program, the differentially expressed mRNAs and proteins in the young panicles of transgenic mutant and control will be screened by sequencing, two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Besides, some candidate ncRNAs and protein genes, which may affect the development and growth of rice panicles, will also be discerned by bioinformatics analyses of the results herein and those on the internet. Expressions of the candidate ncRNAs and protein genes/proteins will further be detected by Northern blot, real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot. Functions of one to two pairs of ncRNAs and protein genes are to be confirmed by transgenic analysis respectively, which will facilitate the understanding of the relationships among OsDCL3b, ncRNA, protein genes and the development and growth of rice panicles, revealing the possible genetic pathways that OsDCL3b controls the development and growth of rice panicles. The results obtained herein will provide crucial basis for thoroughly analyzing the biological functions of OsDCL3b.

在前期研究中，我们获得了OsDCL3b下调表达影响稻穗生长发育的转基因突变株、突变株与对照幼穗中差异表达的ncRNA（no-coding RNA）和OsDCL3b过量表达转基因T0代植株。在此基础上，本项目利用测序、双向电泳和质谱技术分析OsDCL3b基因沉默和过量表达转基因突变株与对照幼穗中的mRNA表达谱及蛋白质组差异，结合网上资源和已有的ncRNA结果，利用生物信息学分析获得影响稻穗生长发育的候选ncRNA、差异表达的mRNA和蛋白质，经Northern blot、荧光定量PCR和Western blot验证其表达后，进行转基因分析获得1-2对重要的ncRNA和差异表达蛋白基因的功能，初步确定OsDCL3b基因、ncRNA、蛋白基因、稻穗生长发育这4者间的相互关系，进而揭示OsDCL3b基因调控稻穗生长发育的可能遗传途径，为深入分析OsDCL3b基因的功能奠定重要基础。

在前一结题国家基金（30860155）工作基础上，本项目进一步完成了：. （1）OsDCL3b的表型功能分析. 发现OsDCL3b下调表达：a）显著降低了水稻突变体的单株产量，主要原因是花粉育性和穗部结实率显著下降；b）显著提高了突变体的稻米品质，如稻米蛋白质和其中的赖氨酸含量均提高了约12%；c）显著降低了突变体籽粒中铜和铅等重金属含量。另外，OsDCL3b的CRISPR敲除突变体的穗部结实率显著降低。. （2）mRNA组和蛋白质组差异分析. 根据表型结果，我们选取了OsDCL3b下调表达突变体和野生型植株的幼穗为材料，对mRNA组和蛋白质组进行了差异分析，获得了许多显著差异表达的候选蛋白基因，并利用qRT-PCR对部分重要候选差异表达蛋白基因进行了验证，还对mRNA存在的可变剪辑现象进行了分析，获得了许多mRNA可变剪接结果。. （3）小分子ncRNA组差异分析. 根据表型结果，我们选取了OsDCL3b下调表达突变体和野生型植株的幼穗为材料，对小分子ncRNA组进行了差异分析，发现OsDCL3b对21和24 nt的小分子ncRNA形成影响较大，获得了许多显著差异表达的小分子ncRNA，进而我们用qRT-PCR验证了一些重要的候选差异表达小分子ncRNA，用于后续转基因功能验证。. （4）重要候选ncRNAs和蛋白基因的转基因功能分析. 依据小分子ncRNA组差异分析结果，我们发现前人已报道显著下调表达的OsmiR397与稻穗产量等性状形成有关，随后我们重点对另外4个重要的候选差异表达小分子ncRNA进行了过量表达和缺失表达转基因功能分析，目前已发现CRISPR技术敲除miR159突变体的稻穗结实率显著降低。依据mRNA组和蛋白质组差异分析结果，我们发现前人已报道显著下调表达的Os03g07250与花药角质和花粉外壁形成有关；随后我们实验发现，从韩国水稻T-DNA插入突变体库中购买的3个差异表达候选蛋白基因的突变体均表现出与稻穗生长发育有关，现已确定其中的Os01g35330基因的T-DNA插入突变体的稻穗结实率显著下降，其具体的分子机理有待深入研究。. 上述结果将有助于深入分析OsDCL3b基因的功能和揭示真核生物基因表达调控的机理，为水稻遗传育种研究提供理论依据。