结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药性新机制研究

The emergence of drug resistant Mycobacterium tuberculsis not only brought difficulties for clinical diagnosis of drug resistant tuberculosis,but also resulted in a desperate short of anti-tuberculosis drugs for the treatment of drug resistant tuberculosis.To alleviate these two big problems, researches on mechanisms of drug resistance are definitely needed.Para-aminosalicylic acid (PAS) used to be one of the most widely used anti-tuberculosis drugs at early times of tuberculosis chemotherapy, and is still a principle second line anti-tuberculosis drug used for treatment of multiple drug resistant tuberculosis.Till present, mechanisms of PAS resistance and also mechanisms of its action still remain largely unknown.Our previous studies showed that, most of the spontaneous PAS resitant Mycobacterium tuberculosis H37Ra and Mycobacterium bovis BCG isolates have mutations in the folC gene， and folC mutations were found in many multidrug resistant M.tuberculosis clinical isolates. Besides， the PAS resistance phenotype of PAS resistant H37Ra could be complemented. Thus, we hypothesize that mutation of folC gene is associated with M. tuberculosis PAS resistance. In this study, biochemical and molecular microbiological techniques will be used to prove this hypothesis. Our study will not only facilitate the development of new tools for PAS resistant tuberculosis diagnosis, but also provides new bases for development of novel anti-tuberculosis drugs.

结核分枝杆菌（结核菌）耐药问题的出现与泛滥，不仅给耐药结核病临床诊断带来巨大的困难，也使得耐药结核病临床治疗面临几乎无药可用的严峻局面。要从根本上缓解上述两大难题，必须从耐药性机制研究入手。对氨基水杨酸（PAS）是最早用于结核病治疗的药物之一，目前仍然是结核病治疗二线药物之一。迄今为止，其耐药机制在很大程度上仍不清楚。本课题组通过前期研究发现，在实验室分离的对氨基水杨酸耐药菌株中，大部分在folC基因中存在突变；并且在许多耐多药结核菌临床分离株folC基因中也发现了类似突变。此外基于遗传学互补实验结果及FolC蛋白质结构数据，我们推测folC基因突变与结核菌PAS耐药性相关。本课题将在此基础上，进一步深入研究folC基因突变与结核菌PAS耐药性的关系，阐明结核菌PAS耐药新机理，为PAS耐药性结核病诊断新方法研究奠定基础，同时为抗结核新药研发提供理论依据。

由结核分枝杆菌（结核菌）感染而引起的结核病是一个全球性的公共卫生问题，尤其是近年来结多耐药和广泛耐药核菌的出现，使得人类在结核病的防控上面临着巨大的挑战。重新评估在过去几十年里我们所使用的临床药物就显得尤为重要。现有药物的作用机理和耐药机理的阐述对于结核病的防控非常关键。. 对氨基水杨酸（PAS），临床上一种用于治疗耐多药结核病的药物，然而结核菌PAS耐药机理至今尚未被完全阐述。PAS作为叶酸前体对氨基苯甲酸（PABA）的结构类似物，在细菌体内可以被二氢喋酸合成酶（DHPS，FolP1）和二氢叶酸合成酶（DHFS，FolC）“活化”，进而抑制二氢叶酸还原酶（DHFR，DfrA）的活性，从而阻断以叶酸为辅酶的代谢通路。因此，FolC蛋白突变会影响PAS在细菌体内的代谢，从而导致结核菌对PAS耐药。. 在本研究中发现，FolC结合底物6-羟甲基-7,8-二氢蝶呤叶酸（H2Pte）的“口袋”处氨基酸发生突变导致实验室分离的PAS耐药菌（结核菌H37Ra和牛结核分枝杆菌）产生耐药性。同时我们也在临床分离的85株MDR菌株中，发现有5株PAS耐药菌株同样在FolC结合底物的“口袋”处氨基酸发生了突变。进一步研究发现FolC的突变会导致二氢叶酸合成酶活性的降低，从而使得PAS无法在细菌体内被“活化”，进而阻断其掺入叶酸代谢。基于以上结果我们也同样发现可以通过导入野生型folC基因到耐药突变菌株中并能够将其对PAS的敏感性恢复到野生型水平。同时我们还发现PAS在体内外均能够被芳香胺乙酰基转移酶（TBNAT）乙酰化修饰并导致其抗结核菌活性大大降低，并且过表达TBNAT能够使得菌对PAS耐受。PAS耐药新机理的发现，不仅有利于建立临床耐药菌株分子诊断方法，还可以帮助我们阐述PAS的作用机理。