甲型H7N9禽流感神经氨酸酶耐药分子机理和传播性研究

The H7N9 avian influenza virus is a new reassortment avian-borne influenza virus, which can cross species and transmit to human, leading to severe pulmonary infection. NAIs are the first-line therapeutic options against the H7N9 virus. But the emerged NAI resistant strains have brought difficult to clinical treatment. R292K and E119V substitution are two most common types of drug resistance site of H7N9 virus. In our previous work, we noted delayed viral clearance in some patients after oseltamivir therapy. Drug susceptibility test showed that the virus strains isolated from these patients were resistant to oseltamivir. But genetic analysis found no known mutation site. To further elucidate the molecular mechanism, eight –plasmid system and animal model were used to validate the resistance site. Animal model is used to comparing the differences in virulence and transmission in wild and resistance strains. Our study will provide theoretical guidance to the clinical drug chosen and the structural transform of NAI.

H7N9禽流感病毒是一种新型禽流感病毒，可以跨物种传播到人，导致严重的肺部感染。神经氨酸酶抑制剂(NAI)是有效的治疗药物，但NAI耐药株的出现，给临床治疗带来了极大困难。 R292K以及E119V是H7N9禽流感病毒中最常见的两种耐药突变位点。在前期的研究中，我们对在抗病毒治疗期间病毒转阴滞后的病人中分离的H7N9禽流感毒株进行药物敏感性检测，发现部分毒株对奥司他韦的药物敏感性下降10倍以上，而基因测序并未发现已知位点的变异。进一步阐明药物敏感性下降的分子机理对于NA抑制剂改造和H7N9耐药预测具有指导意义。本课题将在已有的研究基础上，使用八质粒共转染重组病毒以及动物实验等方法进行耐药位点验证，同时在动物实验水平比较耐药株和野毒株在毒力和传播性方面的差别。为新发流感临床用药以及针对耐药突变的神经氨酸酶抑制剂改造提供理论指导。

在我们早期的研究中发现对奥司他韦敏感性下降的H7N9病毒株，存在家庭聚集发病现象，因此提出科学问题，是否含某一特定位点变异的病毒株，在导致耐药的同时，增加病毒的传播性。本课题首先对2013-2016年临床中分离的H7N9病毒株进行药物敏感性监测，对其中药物敏感性下降的毒株进行测序、比对，寻找新的变异位点。利用反向遗传学技术，包装出点突变的重组病毒，在细胞和动物试验水平，进行变异位点的验证，确定重组病毒的复制性和传播性。课题对2013年-2016年间，隔日留取的H7N9 禽流感病人痰标本进行病毒分离，选用病毒始终未转阴的重症死亡患者、神经氨酸酶抑制剂使用超过5 天而病毒未转阴的患者、病程中使用糖皮质激素以及免疫力下降的患者中分离的36株病毒株进行深度测序。发现其中2013、2015和2016年的分别有1株病毒的IC50值大于100出现耐药情况。对这些所有病毒株的全基因组进行测序，进行生物信息学分析，通过比对耐药株和敏感性下降毒株与敏感性病毒株基因的碱基构成，找出导致耐药或者敏感性下降的基因变异位点，结合病人的临床资料，罗列出可能有意义的变异位点。随后我们发现3株均存在已知耐药位点R289K的变异，其中2株在NA区域同时存在新的变异位点N79S。同样存在R289K的情况下，存在N79S变异的药物IC50值要显著高于N79S并无变异的病毒株。单独N79S变异并不增加IC50值。N79S位点变异在同时存在R289K变异的情况下，增加病毒株对奥司他韦的耐药性。后续还需要在动物水平对两个位点同时变异的重组病毒进行毒力和传播性的比较。