基于病毒结合肽的中枢神经系统双重靶向药物递送系统的构建及其抗乙脑病毒作用研究

The dual targeting drug delivery system, which targets both the blood-brain barrier (BBB) and the central nervous system (CNS), is important for the diagnosis and treatment of virus infection in CNS. Based on the success of the " the virus binding peptide mediated targeting delivery system ", our group proposed to use exosomes as a carrier, which were generated by engineering the imDCs to express lysosomal-associated membrane protein 2 (Lamp2), fused with the encephalitis virus surface protein binding peptide. The modified exosomes were loaded with antiviral drugs for Japanese encephalitis virus (JEV), so as to build a dual active brain targeting delivery system. This delivery system, through the ability of the virus to cross the blood-brain barrier and the neuroticism, specifically binds to the viral particles in the body of the infected JEV, mediating the drug through the BBB to the infected CNS, to improve the anti-JEV effect of drugs.The successful implementation of this study can explore the new dual target delivery strategy of virus infection in CNS, at the same time providing new ideas for the targeted therapy of CNS virus infection.

既能透过血脑屏障又能进一步靶向中枢神经系统的双重靶向药物递送系统对于病毒引起的中枢神经系统感染类疾病的诊断和治疗有着重要的意义。本课题拟在前期“基于病毒结合肽介导的药物靶向转运体系”获得成功的基础上，以乙脑病毒表面蛋白结合肽为靶向分子，并将其修饰至外泌体表面。；利用改造后的外泌体包载抗乙脑病毒药物，构建具有双重主动脑靶向的递送系统。借助病毒能主动穿越血脑屏障以及嗜神经细胞靶向性的特性，通过多肽分子与感染乙脑病毒动物体内的病毒颗粒特异性结合，在病毒感染神经细胞的同时，介导药物穿越血脑屏障并递送至病毒感染中枢神经系统中，提高药物对乙型脑炎的治疗效果。借此探讨中枢神经系统病毒感染类疾病的双重靶向药物递送新策略，为中枢神经系统病毒感染类疾病的靶向治疗提供新思路。

乙型脑炎病毒感染死亡率高、后遗症严重。目前临床上还没有针对乙脑病毒的特异性治疗方法和特效的治疗药物。现有抗病毒药物由于血脑屏障的存在也很难进入被感染的中枢神经系统，因此，研发新型脑靶向递送系统，将药物携带透过血脑屏障进入被感染中枢神经系统至关重要。. 本课题拟构建的基于乙脑病毒表面蛋白结合肽的双重主动脑靶向递送系统，可将药物递送至被感染中枢神经系统，实现对乙型脑炎的靶向治疗。首先，以JEV包膜糖蛋白E为靶分子，采用经典的亲和富集法对噬菌体12肽库进行筛选，经验证发现多肽P63与E蛋白结合活性较高，且具有病毒依赖的细胞摄取增加特性，活体动物成像仪观察小鼠脑内荧光的分布结果显示P63在JEV感染小鼠脑内的摄取率显著地提高。接着，我们构建了P63-Lamp2融合载体，将其转染至细胞中，分离获得用于递送药物的外泌体载体，对该外泌体进行电镜观察和粒度测定，结果表明提取得到的外泌体粒径分别在140nm、150nm和140nm左右。由于探索多种方法都只能分离获得少量表达P63-Lamp2的外泌体，不足以用于后期修饰外泌体包载药物的体内外靶向性及抗病毒效应评价，考虑到获得的JEV表面蛋白结合多肽（JEVBP）P63本身具有脑组织靶向性，因此修改实验方案,将多肽P63与抗JEV核酸序列Raf-1-19直接进行偶连，生成Raf1-19修饰产物Raf1-19-P63（RAF1-19a），细胞摄取、脑组织靶向性及抗病毒活性检测结果均显示结合肽P63的修饰使反义序列Raf1-19在JEV染细胞中的透膜率增加了2.05倍，脑组织靶向性增加了2倍，体外抗病毒活性提高了2.57倍。. 综上，本课题构建的双重主动脑靶向递送系统，可为提高乙脑病毒感染中枢神经系统对抗病毒药物的特异性摄取及临床应用等提供实验依据，为中枢神经系统病毒感染类疾病的靶向治疗提供新思路。