抗凝新药LFG的组成寡糖对内源性凝血途径选择性抑制的研究

Anticoagulant drugs with low bleeding tendency are urgently needed in the treatment of clinical thrombotic diseases. Selective inhibition of the intrinsic coagulation pathway is a promising strategy for developing safer anticoagulants without serious bleeding consequences. LFG is a novel promising anticoagulant as a selective intrinsic Xase inhibitor (IC50 7.5 nM), derived from a lead natural fucosylated glycosaminoglycan (FG). Its intrinsic coagulation inhibitory activity is about 1.5 times stronger than that of enoxaparin (LMWH), while its bleeding tendency is lower. Similar to LMWH like drugs, LFG comprises a series of oligosaccharides with narrower molecular weight distribution. This project is aim to purify oligosaccharides of LFG, to test their effects on the coagulation pathway, particularly their intrinsic Xase inhibitory activity, and to further clarify structure-activity relationship and mechanism of these oligosaccharides. By antithrombotic evaluation and effect on hemostatic function of some oligosaccharides, this research may elucidate the correlation among target mechanisms, anticoagulant activity and inhibition of thrombosis/hemostasis of oligosaccharides. The subject may further enrich basic theory on selective inhibition of the intrinsic coagulation pathway. The in-depth chemical study based on pure oligosaccharide compounds, might promote the discovery of novel anticoagulant candidates that selectively target intrinsic Xase.

出血风险限制了抗凝药物的临床应用。抑制内源性凝血途径可实现预防血栓形成而不影响止血功能，选择性抑制该凝血途径已成为低出血倾向抗凝药物发现的新方向。LFG是以天然岩藻糖化糖胺聚糖为先导化合物经优化获得的寡糖组分，为高选择性内源性Xase抑制剂(IC50 7.5 nM)，抑制内源性凝血活性较依诺肝素强约1.5倍，表现出抗凝活性与出血倾向的分离，但其组成寡糖抑制内源性凝血途径的构效关系及作用机制尚不明确。本项目以LFG为研究对象，分离、纯化及解析其所含寡糖的结构及类型，阐明所含寡糖抑制内源性Xase活性及对凝血途径选择性抑制的构效关系，评估特征性寡糖抑制静脉血栓形成及对止血功能的影响，阐明其靶点机制-抗凝活性-抑制血栓形成/止血功能影响之间的相关性，丰富“选择性抑制内源性凝血途径”基础理论研究内涵。预期获得的高活性候选寡糖分子及构效关系等研究结果，或可促进选择性靶向于Xase的抗凝候选药物发现。

LFG为临床在研的抗凝血创新药物，由一系列低聚糖同系物组成的活性成分。作为一种多组分药物，解析药物与其组分之间的药理活性相关性是一个巨大的挑战。本研究首先对LFG所含寡糖进行了系统分离纯化，共纯化得到九个LFG寡糖组分，分别为五糖（oHG-5）、八糖（oHG-8）、十一糖（oHG-11）、十四糖（oHG-14）、十七糖（oHG-17）、二十糖（oHG-20）、二十三糖（oHG-23）、二十六糖（oHG-26）和二十九糖（oHG-29）。oHG-5 ~ 29 九个寡糖组分是结构清晰的同系物，约占LFG的 95%。与低分子肝素相比，LFG的化学组成相对规则和明确。.本项目进一步研究阐明了LFG（以一个批次的dHG-5为例）及其组成寡糖在抗iXase、f.IXa结合、抗凝血和抗血栓形成等方面的药理作用。dHG-5具有较强的抗iXase活性、f.IXa结合活性、抗凝和抗血栓活性，但不激活f.XII和血小板，出血倾向低。在一定范围内其组成寡糖（oHG-5∼-14），随着聚合度（dp）的增加，这些寡糖的抗-iXase、f.IXa结合和抗凝血活性增加，而oHG-17∼-29接近于完全活性。尽管此前发现八糖是有效抗iXase活性所需的最小结构单元，但oHG-17是具有达到最大活性所需最小链长的低聚糖。dHG-5在抗iXase、f.IXa结合、抗凝和抗血栓形成方面的活性效价接近其寡糖的加权平均值之和。这表明这些寡糖之间没有协同或拮抗作用，dHG-5和oHG-17分子量和活性的相似性也证实了这一点。因此，dHG-5寡糖的贡献可以很好地解释dHG-5的药理活性。此外，dHG-5寡糖的分子量与f.IXa结合、抗iXase、抗凝血和抗血栓形成的关系均符合相似的幂函数，表明这些活性之间存在高度依赖性。药效学实验证明，它们的抗血栓活性来源于抗凝血作用。皮下给予小鼠高、中、低剂量的 dHG-5 后，dHG-5 呈现出线性药物效应动力学特征，表明其药物效应具有可预测性。.因此，本研究纯化获得了LFG组成寡糖单体，并研究了LFG及其组成寡糖药理药效学，阐明了LFG组成寡糖与靶点机制、抗凝活性、抑制血栓形成以及出血倾向之间的相关性规律。本项目研究取得的学术成果有力地支持了作为选择性iXase抑制剂类的新靶点抗凝新药LFG进入临床研究，也为复杂糖类药物的研发提供了借鉴。