烟曲霉Dap家族调控麦角固醇合成与唑类药物敏感性的分子机制研究

The azole drug resistances of Aspergillus fumigatus have been increasing since the last decades due to the worldwide application of azole drug. However, the choice of antifungal drug target is very limited. The studies on the regulation mechanisms of ergosterol synthesis is useful in exploring a novel antifungal drug target and could aid in the study of antifungal drug resistance. We previously found that Dap family (DapA、DapB and DapC）coordinately regulated ergosterol synthesis in A. fumigatus. Interestingly, the strains with point mutations of heme-binding sites in DapB and DapC showed reduced susceptibility to azole compared to the susceptibility of the parental strain, and DapB and DapC mutants mostly localize to the nuclei; The overexpression of DapB and DapC enhanced the susceptibility to azole drug. In the current project, we aim to figure out the molecular regulation mechanism of the interesting phenomenon by using RNA-Seq、genetics, and proteomics assays. We are going to investigate how the the nuclear localization of DapB and DapC decreases azole susceptibility by inhibiting dapB and dapC gene transcription and promoting the transcription of erg4 and erg7 genes. We will construct the molecular mechanism network for the reduction of drug susceptibility by using pull-down、gene deletion, and overexpression assays. We also examine how overexpression of DapB and DapC regulate iron metabolism and enhance azole susceptibility. With these done, we will identify several new antifungal drug target in A. fumigatus.

近年来世界范围内人类病原真菌烟曲霉的耐药现象日趋严重，但目前可选择药物靶标有限。麦角固醇合成调控机制的研究有助于新药靶的发掘和耐药机制研究，本课题前期发现烟曲霉Dap家族（DapA、DapB和DapC）协同调控麦角固醇合成，其中DapB和DapC血红素结合位点突变进入细胞核降低对唑类药物的敏感性；DapB和DapC的高表达则增强对唑类药物的敏感性。本课题拟进一步通过RNA-Seq、遗传学和蛋白质组学相结合的方法系统地揭示该现象的分子调控机制。重点研究DapB和DapC进入细胞核分别抑制自身基因转录和促进erg4和erg7基因转录而降低药物敏感性的分子机制，利用pull-down、基因敲除和过表达等技术，构建药物敏感性降低的分子机制网络。同时利用转录组和遗传学相结合的方法揭示DapB和DapC高表达调控铁代谢和增强药物敏感性的分子机制。通过本项目研究有助于发现特异性的抗烟曲霉靶标基因。

本课题前期发现烟曲霉Dap家族（DapA、DapB和DapC）协同调控麦角固醇合成，在dapA基因敲除背景下，其中DapB和DapC血红素结合位点突变进入细胞核降低对唑类药物的敏感性；本课题拟进一步通过RNA-Seq、遗传学和蛋白质组学相结合的方法系统地揭示该现象的分子调控机制。RNA-Seq数据显示一个编码氧化压力抗性蛋白的基因表达水平显著上升，之前研究已证实唑类药物通过诱导ROS的产生来抑制烟曲霉生长。因此，我们推测oxrA转录上调可能是DapB和DapC血红素结合位点突变进入细胞核降低对唑类药物敏感性的一个机制。随后我们将oxrA基因进行敲除，结果发现OxrA主要通过调控过氧化氢酶（CAT）的活力来参与氧化压力抗性，过氧化氢酶过表达能回补∆oxrA菌的表型缺陷，然而在唑类药物抗性上却没体现出重要作用。重要的是，oxrA基因敲除能降低烟曲霉毒力和改变宿主的免疫反应，结果显示∆oxrA菌能诱导较少的组织损伤，表现为乳酸脱氢酶和白蛋白释放水平显著降低，同时进入肺部的中性粒细胞明显减少，并且与小鼠中性粒细胞募集相关的细胞因子分泌也减少。这些结果表明OxrA在烟曲霉中充当氧化压力抗性和真菌致病的核心调节子。此外，RNA-Seq数据也显示一些鞘磷脂合成代谢相关基因的表达水平也发生显著变化，由于麦角固醇合成与鞘磷脂合成密切联系，随后我们将表达水平降低的ormA 和ISC1基因进行敲除，结果发现ISC1基因敲除增强对唑类药物抗性和氧化压力敏感性，然而ormA基因敲除增加唑类药物的敏感性，同时ormA基因高表达增加对唑类药物抗性。这些结果表明Dap家族蛋白可能通过调控鞘磷脂的合成以影响烟曲霉的耐药性与致病性，更深入的机制研究正在进行。总之，我们的研究结果可为发掘有效的抗真菌药物靶点和新型抗真菌药物的研发提供重要的理论依据。