一种基于L17E多肽介导纳米荧光探针的细胞内lncRNA检测新方法

Long non-coding RNA (lncRNA) plays an important role in epigenetic regulation, cell cycle control and cell differentiation regulation, there have significant values of lncRNA in situ detectiction in diagnosis and research of diseases. The detection of intracellular lncRNA encountered the following dilemma: the nucleic acid probes cannot pass through the cell membrane optionally; the nucleic acid probes are easy to be degraded after entering the cell; the background signals caused by free probes are difficult to be removed. Aiming these problems, we intend to put together the nucleic acid probe and antibody, probe entered cell by endocytosis; we fist take use of lipid-sensitive of Glu-substituted analogues (L17E) of spider venom peptide M-lycotoxin to deliver probes; the antibody and the second antibody creatively mark with fluorescent probes and quenching probes respectively, so background signals are removed on account of antibody- second antibody binding. We also synthesize of nanocluster quantum dots with outstanding features to improve testing and ensure multiple detection. Some breast cancer associated lncRNAs will be detected in different breast cancer cells. Then, a map of these lncRNAs distribution in breast cancer cells will preliminary be established. This project could provide technique support for clinical application of biosensor. Moreover, it would promote the development of intracellular lncRNA detection in clinical diagnosis and disease study.

长链非编码RNA（lncRNA）在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等生命活动中发挥着重要作用，细胞内lncRNA的检测在疾病诊断和理论研究方面有重要的价值。为实现lncRNA简单快速的细胞内检测，还需要解决三个关键问题：核酸探针无法自由的通过细胞膜；核酸探针进入细胞后易降解；游离探针产生的背景信号难以消除。针对上述问题，我们拟把核酸探针和抗体蛋白结合，通过内吞进入细胞；率先利用多肽（L17E）介导核酸探针，防止探针被降解；创新性地将抗体与二抗分别标记于荧光探针和猝灭探针上，待二者结合后产生临近连接效应消除背景信号。我们还将合成荧光特性优异的纳米量子点，提高lncRNA的检测特异性和实现多重检测。我们拟检测多种乳腺癌调控相关的lncRNA，建立这些lncRNA在不同乳腺癌细胞中的分布图谱。该项目的实施将为生物传感的临床应用提供全新技术，促进细胞内lncRNA检测在诊断及科研中的运用。

国内检验技术已经发展了数十年，基于生化、免疫和分子等技术构建了非常多的检验方法。得益于这些方法的建立，医生能够获得很多的临床指标结果，实时掌握病人身体情况，及时诊断病情和调整用药。新冠肺炎疫情期间，疾控机构就通过对病毒核酸的筛查诊断病情，为疾病的防控起到关键作用。此外，随着检验技术的发展，能够检测到的指标更多更全，我国的医学科研也实现了突飞猛进的发展，为人民健康事业发展做出了巨大贡献。可以说每次检验技术的革新会带来医学发展的革新，新的检验技术往往可以突破医学研究的瓶颈，让医学研究达到更高的台阶，例如分子诊断的发展、组学检验的发展。可以说检验技术的发展是现代医疗发展的催化剂、助燃剂，但是现有的检验技术还远远不够，目前拥有的检验方法并不能满足所有的检测需求，即使一些常用的方法也有很多值得提升的空间。本项目的研究的目的就是建立一些新的检测策略，用于满足临床和科研在某些场景的检验需求，为推动临床和医学科研的发展做出贡献。. 疾病标志物准确快速检测在疾病的早期筛查、风险性评估、快速诊断等方面有着广泛的临床价值和应用。我们利用脂质敏感多肽 L17E 溶解核内体膜介导探针进入细胞，利用抗体与二抗结合形成临近连接效应降低背景信号，建立了一种针对lncRNA的原位检测新方法，为临床诊断和生命科学研究提供新的技术手段。我们还围绕前期实验中发现的现象出发，利用富含G碱基的核酸适配体构象变化时会猝灭荧光这一现象，设计并建立了针对癌胚抗原的快速、经济检测方法，为疾病的风险评估、早期诊断、预防和治疗以及临床医师的针对性用药提供依据。我们还基于 纳米微球DNA walker 建立了新型的检测DNA的生物传感器方法，利用此方法快速高效特异的检测了B组链球菌DNA。本方法的建立有助于推动DNA walker技术在临床诊断中的应用发展，并且本方法具有通用性，只需要改变探针序列就可以对其他目标物进行检测。