胞质动力蛋白在三疣梭子蟹精子顶体形成过程中的功能分析

The mechanism of acrosome formation in crab sperm is one of the hot topics in the crustacean reproduction research. To date, the function of cytoplasmic dynein during crab sperm acrosome formation is still unknown. Our preliminary work demonstrated that during Portunus trituberculatus spermiogenesis, cytoplasmic dynein’s heavy chain pt-DHC1 and mid-chain pt-DIC1 showed an overlapped temporal and spatial pattern with acrosome formation, and it can possibly participate in vesicle transport and acrosome structure formation through facilitating the acrosome tubule formation by motor traction. This project intends to establish the in vivo gene interference and protein function blocking system to explore pt-DHC1 and pt-DIC1’s functions during acrosome biogenesis. At in vitro level, we wish to apply CRISPR/Cas9 gene knock-out and rescue techniques, and utilize the live cell imaging to analyze the gene function of pt-DHC1 and pt-DIC1 so as to uncover their roles in vesicle transport and acrosome formation during spermiogenesis. This study will reveal cytoplasmic dynein’s function during crab sperm acrosome formation, illustrate its functional mechanism during spermatogenesis, and provide valuable guidance to artificial fertilization and reproduction of Portunus trituberculatus.

蟹类精子顶体形成的动力学机制是甲壳动物生殖生物学研究热点之一。迄今胞质动力蛋白在蟹类精子顶体形成过程中的功能未知。我们前期工作发现，在三疣梭子蟹精子形成过程中，胞质动力蛋白的重链pt-DHC1和中间链pt-DIC1的时空表达模式与顶体的形成有关，其可能参与囊泡运输和顶体结构的形成；通过其动力牵引协助顶体管形成。本项目拟在活体水平上，采用基因干扰、蛋白功能阻断等技术探索pt-DHC1和pt-DIC1在顶体生物发生中的作用；在离体水平上，拟建立CRISPR/Cas9基因敲除和基因功能援救体系，用活细胞成像等技术，分析pt-DHC1和pt-DIC1基因的功能，研究其在精子形成中参与囊泡运输和顶体形成的功能。结果将揭示胞质动力蛋白在蟹类精子顶体形成过程中的功能，阐释该蛋白在精子发生过程中的作用机制，对三疣梭子蟹的人工受精和繁育亦具有指导价值。

该项目是研究胞质动力蛋白在三疣梭子蟹精子顶体形成过程中的功能，结合运用分子和细胞生物学技术从不同角度阐明其对顶体形成以及精子发生的作用。首先，通过组织学技术对三疣梭子蟹精巢发育以及精子发生过程进行了系统研究，完善了三疣梭子蟹雄性生殖系统的形态学特征；其次，通过分子生物学技术获得了胞质动力蛋白的重链和中间链的全长序列并通过生物信息学技术对其结构进行分析；再次，通过系列生物学技术明确了胞质动力蛋白在三疣梭子蟹精子顶体形成过程中的分布情况以及运输货物，同时发现其在细胞核形变过程中也具有重要功能；通过活体注射胞质动力蛋白抑制剂研究胞质动力蛋白对三疣梭子蟹精子发生的影响，并初步探索了胞质动力蛋白对雄性生殖系统的影响，该部分内容获得2019年浙江省生命科学竞赛二等奖。综合上述研究结果，本研究为精子发生动力学机制的研究奠定了坚实的工作基础。项目资助发表SCI论文2篇，会议论文1篇，待发表2篇。培养学生总计5人次，其中2名已经取得硕士学位，3名在读。项目所剩余经费将继续应用于本项目未完成部分实验，研究成果后续将及时向基金委汇报。