AAV介导的缺氧诱导型NGF转染神经干细胞对脊髓损伤作用及机制研究

Spinal cord injury (SCI) has proven to be very difficult to repair. The neural stem cell is hope for the treatment of SCI patients. Nerve growth factor (NGF) is one of the essential neurotrophic factor for stem cells, and has the strong capability of differentiation and proliferation. This project prophase research found that liposomes packaging NGF can regulate autophagy to promote the restoration of SCI in rats, but it can't repair syringomyelia, nor it can regulate the expression level of NGF in the hypoxic microenvironment. Therefore, in this project, we have successfully built low oxygen controlled expression of NGF via adeno-associated virus vector to generate a genetically modified neural stem cell system. This project intends to employ the genetically modified stem cell transplantation to rat acute SCI model, through the hypoxia-regulated NGF expression, and to explore the effect of genetically modified stem cells on the repairing function of SCI. We aim to investigate the influence of inflammation, oxidative stress, the change of the micro environmental factors such as angiogenesis; and focus on autophagy in neural stem cells and the repair mechanisms as well as the role of hypoxia-regulated NGF in this process. Overall, we aim at providing a new treatment strategy for the study of the SCI and for in-depth theoretical basis.

脊髓损伤(SCI)修复困难，神经干细胞是治疗SCI患者的希望。神经生长因子(NGF)是干细胞分化必需的神经营养因子之一，具有较强的促分化和促增殖能力。本项目前期研究发现脂质体包载的NGF能调控自噬促进大鼠SCI修复，但是无法修复脊髓空洞，更无法及时根据缺氧微环境变化调控NGF的表达量。因此，在本课题组已经成功构建的低氧调控性NGF腺相关病毒载体的基础上，拟用基因转染技术获得可控性基因修饰神经干细胞体系。本项目拟将上述可控性基因修饰干细胞移植至大鼠急性SCI模型，通过低氧调控NGF表达，探讨可调控性基因修饰干细胞对SCI功能修复的影响，观察炎症反应、氧化应激、血管再生等微环境因素的变化；重点关注自噬在神经干细胞分化和促修复过程中的相关机制及其与NGF基因调控的联系，旨在为SCI研究提供新的治疗策略和深入的理论基础。

脊髓损伤后缺血缺氧的微环境使得脊髓损伤的修复成为一个具有挑战性的问题。在各种刺激下，神经干细胞(NSCs)分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的机会很大，被认为是脊髓损伤干细胞治疗的潜在来源。我们的研究使用腺相关病毒(AAV)携带目的基因转染神经干细胞。转染的NSCs可以表达由缺氧反应元件(5HRE)引导的神经生长因子(NGF)。因此，5HRE-NGF-NSCs可在缺氧部位特异性表达NGF，促进组织修复和功能恢复。基于脊髓损伤模型中神经细胞的再生和促进恢复，通过BBB评分及脚步印记等进行运动功能评估、组织化学染色和分子检测，我们的结果表明5HRE-NGF-NSCs可以改善脊髓损伤大鼠的运动功能、NEUN等指标在治疗后大量表达证明神经元存活。同时，自噬相关蛋白LC3, P62, Beclin等表达下调表明5HRE-NGF-NSCs对自噬的抑制作用。我们的研究表明，5HRE-NGF-NSCs可能通过抑制自噬和提高神经元细胞存活率来促进脊髓损伤的修复。这种新疗法还能抑制神经胶质瘢痕增生，诱导轴突再生。5HRE-NGF-NSCs的这些积极功能都表明有希望治疗脊髓损伤。.为了对比NGF的实验效果，我们同时加入了bFGF等生长因子和干细胞的对照组，更进一步的对比。人牙髓干细胞(Human dental pulp stem cells, DPSCs)是一种数量丰富且免疫排斥反应低的干细胞，具有高度增殖和多系分化能力，可用于自体移植。此外，DPSCs可以很容易地从新鲜提取的牙齿中分离出来，而不会对健康造成不利影响，可以考虑用于细胞替代治疗。利用AAV-5HRE搭载bFGF和DPSCs原位注射损伤区域。经过治疗发现，DPSCs可向CD13+周细胞分化，并上调N-cadherin表达，促进CD13+周细胞与血管内皮细胞的再附着。CD13+周细胞与血管内皮细胞的再附着通过突起的收缩增加了微血管内的血流速率。结果增加的红细胞携带更多的氧气到损伤区域，改善了脊髓损伤的局部缺氧微环境。综上所述，我们在AAV-5HRE搭载生长因子与神经干细胞治疗脊髓损伤中进行了深入的研究，针对脊髓损伤后损伤区缺氧情况下特异性表达生长因子，修复损伤区血管及神经元，进而达到促进运动功能恢复的作用，因此，此项研究为AAV-5HRE搭载生长因子与神经干细胞在脊髓损伤治疗中的临床应用迈出了一步。