飞蝗肌钙蛋白复合体的序列分析与功能研究

The locust Locusta migratoria is an important agricultural pest as well as a model animal to study insect muscle physiology. Troponin (Tn) complex consists of three subunits, named TnC, TnI and TnT, which is a key protein of the regulation of muscle contraction. Our previous study showed that locust has multiple TnC genes, encoding multiple proteins, and has only one TnI gene and one TnT gene, encoding multiple proteins by alternative splicing. We speculated that Tn complex in different locust muscle has different calcium response and regulates muscle contraction differently. In this study, we will focus on the following three specific aims: 1) Determine the TnC, TnI, and TnT genes, and their tissue-specific expressions. We will determine the full length sequence of the genes, analyze the possible coding forms, and investigate their distributions in various muscles. 2) Study calcium responsive properties of Tn complex. We will first produce the recombinant proteins of each subunit of Tn complex and assemble them into different Tn complex. Then, we will compare the Ca2 + affinities and kinetic of these complexes. 3) Analyze the effects of Tn complex on the Ca2 +-regulated myosin activity. This study will reveal the relationship between the structure and function of the locust Tn complex, and will be helpful to clarify the molecular regulation mechanisms of locust muscle contraction.

飞蝗是重要的农业害虫，也是研究昆虫肌肉生理的模式动物。飞蝗的各种肌肉组织具有不同的收缩特性，其分子机制尚不清楚。肌钙蛋白(Troponin,Tn)复合体由TnC,TnI和TnT三个亚基组成，是控制肌肉收缩的开关蛋白。我们前期研究表明飞蝗有多个TnC基因，编码多种TnC蛋白；只有一个TnI基因和一个TnT基因，可选择性剪切编码多种蛋白。推测飞蝗各种肌肉的Tn复合体具有不同的钙响应特性，对肌肉收缩的调节也不同。本研究将：1）确定飞蝗Tn复合体三个亚基的种类和序列。在获得基因全长基础上分析其编码形式，确定在飞蝗不同肌肉组织中的表达特性。2）研究Tn复合体的钙离子响应特性。利用重组表达获得Tn三个亚基蛋白，组装成不同的Tn复合体，比较它们对钙离子响应的差异。3）分析Tn复合体对钙离子调节肌球蛋白马达活性的影响。本研究将揭示飞蝗Tn复合体的结构与功能关系，为阐明飞蝗肌肉收缩调节的分子机制奠定基础。

飞蝗是研究昆虫肌肉生理的模式生物。飞蝗飞行和跳跃过程中的运动生理和代谢特点研究的较为深入，但其运动过程中肌肉收缩调控的分子机制不清楚。随着飞蝗全基因组和转录组测序的完成，为我们在分子水平上研究飞蝗肌肉系统结构与功能的关系奠定了基础。.肌钙蛋白复合体Tpn是调控肌肉收缩的关键蛋白，由肌钙蛋白C (TpnC)、肌钙蛋白I (TpnI)和肌钙蛋白T (TpnT)三个亚基组成。我们首先分析了Tpn复合体亚基的基因序列，鉴定出一个LmTpnT, 一个LmTpnI和三个LmTpnC基因。LmTpnT由11个组成型外显子和一个可变剪切外显子组成，能够编码两种TpnT亚型；LmTpnI由六个组成型外显子、两个可变剪切外显子组成，可以编码八种TpnI亚型。蝗的飞行肌和跳跃肌表达相同的TpnT亚型，但表达不同的TpnI和TpnC亚型。.其次，测定TpnC对钙离子的响应。跳跃肌TpnC3钙离子亲和力显著高于飞行肌TpnC1。在20°C，Mg2+条件下，TpnC1钙离子从调控位点快速解离的速率为22.6 /s， TpnC3快速阶段的解离速率为13.3 /s，正是由于TpnC1较低的钙离子亲和力导致其较快的钙离子解离速率.最后，研究Tpn复合体对肌球蛋白马达活性的调节。低钙条件下，飞行肌Tpn111对肌球蛋白ATPase活性的抑制低于跳跃肌的Tpn331。高钙条件下，Tn331调控的肌球蛋白ATPase活性能够产生强的钙离子依赖的激活，而Tpn111只能部分激活肌动球蛋白。我们也测定肌球蛋白在actin上的运动速率。Tpn331调控的运动速率约是Tpn111的2倍。这些结果表明Tpn331能够增加肌球蛋白头部的催化活性，导致更强的收缩性。.综上所述，本文研究了肌钙蛋白复合体在肌肉收缩调控中的作用。研究结果表明，不同TpnC钙离子结合交换动力学的差异，产生钙离子依赖的细丝激活程度的差异。上述研究结果为揭示飞蝗飞行和跳跃肌肉收缩调节机制奠定了基础。