基于能量调控的生物催化过程研究

生物催化过程往往同时包含能量代谢过程和物质代谢过程，能量代谢直接影响物质代谢，能量代谢速率与物质代谢速率不相匹配是造成生物催化效率低下的根本原因。本项目面向工业生物过程，拟以生物合成胞二磷胆碱为研究对象，探讨酵母全细胞生物催化中能量代谢与物质代谢相互影响机制，揭示代谢过程中物质流和能量流的通量分配关系，通过能量代谢调控，使能量代谢速率与物质代谢速率相匹配，最终实现目标产物的高效生物合成。本项目主要开展三方面研究工作：首先，建立基于能量流和物质流的新型代谢平衡分析方法；其次，解析能量代谢与物质代谢的相互影响机制；最后，构建可控的能量再生与耦联体系。本项目将较系统的阐明生物催化过程中能量代谢调控的一般方法和普遍规律，为其它生物催化体系提供理论基础和研究方法，推动我国绿色化工的发展。

本项目以CDP-胆碱高效合成为研究目标，基于生理功能工程以及能量再生与耦联理论和方法，就CDP-胆碱合成的关键因素及其调控机理和能量再生效率的调控开展研究。主要研究内容与结果如下：.1．通过简化CDP-胆碱生物合成的代谢网络模型，利用通量平衡分析计算实验和理论的代谢通量分布。代谢通量分布结果显示，通过强化底物水平磷酸化，解除高能荷对糖酵解途径的抑制，在体系中维持高能量水平，才能满足CMP和胆碱的磷酸化需要，同时保护关键酶，最终提高CDP-胆碱合成效率和能量利用效率。.2．针对ATP再生效率低下的问题，采用添加铵离子、乙醛等小分子效应物的策略，解除了ATP对糖酵解关键酶的抑制，改善了细胞的氧化还原状态，提高了细胞的能量再生效率，提高了CDP-胆碱的产率。30 mmol/L铵离子解除高ATP水平对糖酵解代谢速率的抑制，磷酸果糖激酶的活性提高了20%，能量利用效率提高到8.6%。120 mmol/L乙醛使NAD+浓度提高了66.7%。经过24h反应生成11.70 g/L CDP-胆碱，能量利用效率提高到12.1%。.3．通过对Kennedy途径关键影响因素的考察，提高该途径的代谢通量，使之与能量再生途径高效耦联。结果表明，外加1%甘油缓解了细胞膜受到的来自胞外的高渗透压，保护胞苷转移酶的立体构型。另外，1%甘油的加入，减弱甘油支路的通量，提高能量的利用效率。经过24h反应，CDP-胆碱浓度提高到9.38 g/L，比对照提高了27.7%，能量利用效率达到9.7%。.4．考察各因素对CDP-胆碱体系综合调控的影响，优化反应体系，并对优化前后代谢通量分布进行对比分析。利用铵离子、乙醛和甘油共同调节啤酒酵母催化合成CDP-胆碱体系，结果发现，在CDP-胆碱合成初期，厌氧条件下，葡萄糖被快速消耗，进入糖酵解途径。NADH/NAD+减小，增大了糖酵解途径的通量，提高了ATP再生效率，FBP的积累通量增大了近4倍。甘油支路的通量减少了60%，ATP的再生效率增加了28.2%。合成期时，胆碱磷酸化的通量比对照提高了42.4%。合成末期，CDP-胆碱的合成速率比对照有所增加。最终CDP-胆碱浓度达到16.44 g/L，对CMP的得率达到78.3%，能量利用效率达到17.0%。